钱卫庆，尹 宏，孙海涛

    1.南京中医药大学第三附属医院(南京市中医院)骨伤科，江苏 南京 210001；2.南京中医药大学，江苏 南京 210029

    中药淫羊藿很早即被应用于治疗抗骨质疏松症的复方中[1-2]，但其抗骨质疏松作用机制直到近年才引起人们的高度重视，其中淫羊藿对成骨细胞的作用更是成为此领域的一大研究热点[3-6]。近年，学者对淫羊藿苷作用于成骨细胞的研究较多，但淫羊藿苷对成骨细胞增殖、分化作用的具体浓度尚存在异议[7-9]，本实验通过建立大鼠离体成骨细胞培养体系，检测不同浓度淫羊藿苷对成骨细胞增殖和功能的影响，为进一步探讨淫羊藿苷防治骨质疏松的机制奠定实验基础。

    1 试药与方法

    1.1 药品及试剂

    淫羊藿苷：南京泽朗医药科技有限公司；胰蛋白酶：美国Amresco公司；Ⅱ型胶原酶：南京生兴生物技术有限公司；碱性磷酸酶染液及碱性磷酸酶活性测定试剂盒：南京建成生物工程研究所。

    1.2 方法

    1.2.1 大鼠成骨细胞的分离和培养

    将6只出生后24 h内的SD大鼠(南京军参照区总院动物试验中心提供)脱颈处死，取颅骨，具体培养方法见参考文献[10]。

    1.2.2 成骨细胞鉴定

    1.2.2.1 碱性磷酸酶定性染色 (偶氮偶联法)原代培养的成骨细胞生长约85%汇合，0.25%胰酶消化后，接种于铺有盖玻片的培养皿。按照碱性磷酸酶染液试剂盒的说明书进行操作。

    1.2.2.2 钙化结节染色 (茜素红法)原代培养的成骨细胞生长约85%汇合，0.25%胰酶消化后，接种于培养瓶。染色步骤：在培养瓶中用PBS冲洗2次，95%乙醇固定10 min，三蒸水冲洗 3 次，加入 0.1%茜素红-Tris-HCl(pH 8.3)37℃，30 min，三蒸水冲洗，干燥，镜下观察。

    1.2.3 MTT法检测淫羊藿苷大鼠成骨细胞增殖的影响

    以每孔5000个细胞接种于96孔培养板，置于含5%CO2的37℃细胞培养箱中培养24 h后成骨细胞贴壁，按实验设计，分别加入浓度为 100.0、40.0、20.0、10.0、1.0、0.1 μg/L的淫羊藿苷和无淫羊藿苷的无血清DMEM培养液，在含5%CO2、37℃培养箱中培养24 h。吸弃上清液 ......