李 军 ，黄 霞 ，姚雪梅 ，陈雪芬 ，齐兴柱

    1.热带生物资源教育部重点实验室，海南海口 570228；2.海南大学海洋学院，海南海口 570228

    E.coli DH10B碱性磷酸酶基因的克隆、表达及活性研究

    李 军1,2，黄 霞2，姚雪梅2，陈雪芬2，齐兴柱2

    1.热带生物资源教育部重点实验室，海南海口 570228；2.海南大学海洋学院，海南海口 570228

    目的：克隆并表达E.coli DH10B碱性磷酸酶(AKP)成熟肽基因(phoAm)，为AKP的定向改构及应用奠定基础。方法：采用PCR法从E.coli DH10B基因组扩增phoAm；将phoAm克隆入表达载体pET28a，再转入E.coli BL21(DE3)进行表达；用免疫金层析法和SDS-PAGE法检测表达的重组rAKP；采用对硝基酚磷酸(pNPP)法测定rAKP的活性。结果：rAKP单体分子量约47 K，活性分析比对照菌提高21.5倍。结论：获得AKP成熟肽基因并得了到具有较高活性的重组rAKP。

    碱性磷酸酶；大肠杆菌DH10B；表达纯化；活性分析

    碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)是一类非特异性磷酸单酯酶，可催化磷酸单酯的水解[1]。AKP广泛存在于多种细菌、真菌和动物中。不同来源的AKP的相对分子质量和编码序列差异很大，且各种AKP的性质、结构、功能和催化机制也不完全相同。其中，E.coli AKP由phoA基因编码，为同源二聚体金属酶，单体由449个氨基酸组成，相对分子质量为47 K，活性中心包括3个金属原子，即2个锌原子和1个镁原子[2]。

    E.coli AKP催化机制明确，底物范围广泛，作为工具酶在表位连锁、组织化学、免疫印迹、突变分析等方面有广泛应用。E.coli DH10B无致病性和耐药基因，是基因克隆的常用受体菌。本研究首次从E.coli DH10B基因组中克隆了AKP的成熟肽基因(phoAm)并进行了表达研究 ......