隋玉东 王晓民 杨德君 王科亮

    哈尔滨医科大学附属四院泌尿外科，黑龙江哈尔滨 150001

    肾癌是泌尿系统中最常见的肿瘤，在治疗上通常采用的是手术治疗，但是在早期诊断时有大约30%的患者存在转移的现象，其转移的主要方式是血道转移和淋巴道转移[1]。肿瘤的转移是涉及很多因子的复杂过程，研究发现有很多因子参与转移过程，最值得关注的是血管内皮生长因子VEGF，其是通过旁分泌的方式释放，从而刺激肿瘤血管的生成，加快肿瘤的生长，VEGF不仅加快血管生长速度，也增加血管的通透性，Ferrara等[2]报道中提及肾癌的肿瘤的生长是通过自分泌和有通透性的作用。为了减少肾癌的远处转移和抑制肿瘤的生长速度，采用了对siRNA和血管内皮生长因子的研究，探讨肾癌的治疗前景。

    1 材料与方法

    1.1 实验体外过程

    1.1.1 实验材料 肾癌细胞786-0由实验室自身提供，siRNA的设计：在Gene Bank查找编码人VEGF cDNA的序列，应用Ambion公司RNAi设计软件并参考有关文献，进行全基因组扫描和序列同源分析，设计针对VEGF mRNA不同剪接子的RNAi作用的公共靶点，上述由广东锐博合成所需的编码RNA，然后由该公司转导质粒中。

    1.1.2 方法 siRNA的合成：广东锐博根据提供参考的碱基对5′-GATCCACCTCACCAAGGCCAGCACTTCAAGAGAGTGCTG GCCTTGGTGAGGTTTTTTTTGGAAGTCGACA-3′(有义链)；3′-GTGGAGTGGTTCCGGTCGTGAAGTTCTCTCACGACCGGAA CCACTCCAAAAAAACCTTCAGCTGTTCGA-5′，合成目的 siRNA。

    1.1.3 质粒的转导和提取 由广东锐博根据碱基序列合成所需的质粒，并由广东锐博将质粒转导大肠杆菌中，再放进摇箱进行摇晃，观察甘油菌的生长情况，同时加氨苄西林将非耐药的大肠杆菌杀死，使其含目的质粒的基因在大肠杆菌内大量繁殖。然后将质粒提取检测质粒，加入甘油进行保存。

    1.1.4培养细胞 将实验室提供的肾癌786-0细胞系放置于人工培养液血清1640中，每24小时更换培养液，置于37℃温箱中进行繁殖、传代，冻存以备后期使用。

    1.1.5 细胞分组和转染细胞 将培养的肾癌细胞进行分组，分为空白组、目的组、含空质粒组、其他干扰因子组四组，转染前24 h ......