邹家琼 杨国珍 敬 鹏 罗昭逊

    1.贵阳医学院医学检验系，贵州 贵阳 550004；2.川北医学院检验系，四川 南充 637000；3.川北医学院附属医院小儿外科，四川 南充 637000

    ΔNp63是p63基因转录的产物之一，在结构上与p53具有高度的相似性，属于p53家族，主要表达于表皮、宫颈、泌尿系统等具有鳞状上皮分化潜能的基底细胞和旁基底细胞。最新的研究报道[1-2]，ΔNp63基因在上皮源性肿瘤中改变了肿瘤的侵袭、转移作用。ΔNp63在各不同组织学类型的子宫颈癌中高表达，且与肿瘤的分级相关[3]。这提示ΔNp63在宫颈癌发生、发展过程中起到重要的作用。为研究ΔNp63基因在宫颈癌中迁移、侵袭的机制，本研究针对人ΔNp63基因设计并合成小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)干扰此基因的表达，同时在体外进行观察ΔNp63基因对HeLa细胞迁移和侵袭能力的影响。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    人宫颈癌细胞株HeLa细胞购于中国科学院上海细胞库；pGeneSil-1质粒购于武汉晶赛公司；lipofectamineTM2000购于Invitrogen公司；质粒提取试剂盒购于Omega公司。RPMI-1640购于武汉博士德生物工程有限公司；胎牛血清购于TBD公司。小鼠抗人ΔNp63多克隆抗体、小鼠抗人GAPDH单克隆抗体及兔抗小鼠IgG-HRP二抗均购于Santa Cruz公司。10×SDS-PAGE电泳缓冲液以及SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购于上海宝曼生物科技有限公司；PVDF膜购于Millipore 公司；其他试剂如：DEPC、MTT、G418、DMSO 等均购自Sigma公司。Transwell细胞培养小室购自Corning公司。

    1.2 方法

    1.2.1 siRNA的设计、合成和标记 在GenBank查找人源ΔNp63基因序列，根据siRNA设计原则，并参考文献[4-5]，设计针对ΔNp63基因靶点的特异性寡核若酸序列，其序列为：AATGCCCAGACTCAATTTAGT；阴性对照siRNA是没有靶基因的无关对照小RNA。GFP标记的siRNA和阴性对照siRNA。以上序列均由武汉晶赛生物工程技术有限公司合成。

    1.2.2 细胞培养、瞬时转染及细胞分组 HeLa细胞在37℃、5%CO2的细胞培养箱中用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，规范换液传代。转染前利用胰酶消化收集细胞 ......