黄丽丽 王文军 李瑞岐 欧阳能勇 杨冬梓

    中山大学孙逸仙纪念医院生殖中心，广东广州 510120

    卵巢组织冷冻可以为卵巢早衰或癌症需要放化疗的患者提供恢复生育能力及内分泌功能的可能性[1]。玻璃化冷冻是近年来出现的一种新的冷冻方法，该技术将冷冻对象直接投入液氮中快速降温，避免冰晶形成，可以绕开组织内不同细胞成分对慢速冷冻参数要求不同的技术障碍，从而提高冷冻保存效果。玻璃化冷冻的降温速度直接决定冷冻保护剂能否形成玻璃态，而使用的载体是影响降温速度的最重要因素。虽然目前应用玻璃化方法冻存人卵巢组织已有陆续报道，其中采用的载体包括冷冻管[2]、开放式麦管[3]、最小微滴法[4]以及不锈钢网筛[5]等，然而究竟何种载体更适合人卵巢组织玻璃化冷冻，需进一步研究。固相表面玻璃化技术(solid-surface vitrification，SSV)是近年新出现的一种简便有效的玻璃化方法，笔者前期曾成功将其用于玻璃化冷冻人卵巢组织片，并取得了与慢速程序化冷冻相当的效果[6]。本研究的目的是比较固相表面玻璃化冷冻和其他载体相比，对人卵巢组织玻璃化冷冻的效果。

    1 材料与方法

    1.1 人卵巢组织标本的收集与预处理

    卵巢标本取自2011年11月～2012年6月就诊于中山大学孙逸仙纪念医院妇产科、需经腹或行腹腔镜手术的16例患者，年龄 21～40 岁，平均(32.7±5.9)岁；有规律的月经史，无内分泌紊乱，无放化疗史，半年内无激素服用史，且卵巢囊肿直径<7 cm。其中，良性卵巢囊肿8例，子宫肌瘤5例，宫颈癌3例。所有患者均签署知情同意书，本研究得到了中山大学孙逸仙纪念医院伦理委员会的批准。

    新鲜卵巢组织浸泡于含10%人血白蛋白+青链双抗的L-15培养液(Gibco公司)中，于体式显微镜下去除多余髓质后，切成约5 mm×1 mm×1 mm大小的皮质小条，随机分配到不同的实验组：新鲜组(F组)、冷冻管玻璃化组(TV组)、最小微滴玻璃化组(MDS组)、不锈钢网筛玻璃化组(SLV组)和固相表面玻璃化组(SSV组)。新鲜组直接以4%多聚甲醛液固定。

    1.2 玻璃化冷冻和复苏过程

    采用含有20%乙二醇(ethylene glycol，EG)+20%二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)的L-15溶液为玻璃化冷冻液。将卵巢组织依次浸泡于4℃25%、50%、75%和100%浓度的玻璃化冷冻液中逐步导入冷冻保护剂后，采用不同载体行玻璃化冷冻：①TV组将卵巢置于含有1 mL 4℃100%玻璃化冷冻液的无菌冷冻管中投入液氮；②MDS组用无菌的巴氏管将卵巢组织直接滴入液氮中；③SLV组将卵巢组织置不锈钢网筛上投入液氮中；④SSV组将卵巢组织置于已在液氮中预冷的铝箔上投入液氮中 ......