丁治国 何 蓓 陈晓珩 汪唐顺 高 翔 李乃卿

    1.北京中医药大学东直门医院，北京 100700；2.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029

    血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是特异性血管内皮细胞有丝分裂素，与受体结合后促进内皮细胞分裂、增殖、迁移，加速形成新生血管。研究表明，VEGF及其受体在肝癌癌组织中较正常肝组织呈过表达，并与肝癌的生长、转移、复发及治疗密切相关[1-3]。因此，VEGF已成为目前肿瘤抗血管治疗的热点。笔者前期研究发现课题组原研药物参芪扶正注射液可显著抑制人肝癌细胞MHCC97L的生长、侵袭能力，并能下调VEGF基因表达。为进一步明确VEGF基因“沉默”时药物作用的变化，本研究构建了能转录产生VEGF shRNA的质粒，进而构建并包装产生高滴度的慢病毒RNAi载体，并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中表达，抑制MHCC97L细胞中VEGF基因的表达，为进一步深入研究VEGF基因与参芪扶正注射液药物效果的关系奠定基础。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    Platimum HIFI Taq Polymerase高保真扩增酶、Trizol Reagent、5×First-Strand buffer、0.1 mol/L dTT、SYBR Green I、Rnase out、oligo dT/Random primer/特异性引物、10×PCR Buffer、Mg2+(50 mmol/L)、Platinum Taq DNA Polymerase、100 mmol/L

    dNTPs(购自美国Invitrogen公司)；T载体、plenti6.3MIR载体、293细胞、DH5α感受态细胞、ddwater(购自上海诺百生物科技有限公司)；T4 Ligase(购自加拿大NEB公司)；DMEM培养基(购自美国HYCLONE公司)；FBS(购自法国biowest公司)；24孔和6孔细胞培养板(购自美国Corning公司)；荧光显微镜(购自日本Olympus公司)，荧光定量PCR仪(购自美国Bio Rad公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 载体的构建和鉴定 针对人类VEGF基因mRNA序列(NCBI GenBank ......