段朝霞 张洁元 陈魁君 王建民 李兵仓

    1.创伤、烧伤、复合伤国家重点实验室，重庆 400042；2.第三军医大学野战外科研究所六室，重庆 400042

    少突胶质细胞是中枢神经系统的髓鞘形成细胞，它的主要功能是产生髓鞘包绕神经轴突，维持神经冲动沿轴突跳跃性传导；另外它还分泌多种神经营养因子，支持神经元的生长与存活[1]。少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells，OPCs)是处于分化早期阶段的未成熟细胞，具有良好的增殖能力，能在体内增殖、迁移，最后分化为成熟少突胶质细胞并为髓鞘形成发挥重要作用。高纯度OPCs的制备、培养是一切研究工作的基础，目前，国内外对大鼠OPCs的培养报道很多，有关小鼠OPCs的培养方法及研究报道还比较少，本文参照国内外文献报道的新生大鼠OPCs的培养方法[2-3]，探索小鼠OPCs的培养及鉴定，并研究重组巨噬细胞移动抑制因子(rMIF)对其增殖活性的影响，为进一步深入研究其发育、分化以及移植治疗脊髓损伤等奠定基础。

    1 材料与方法

    1.1 主要试剂及仪器

    高糖DMEM培养基、胎牛血清为Gibco产品，100 ×N2 添加物为Invitrogen公司产品，PDGF-AA及bFGF为Peprotech公司产品，山羊抗大鼠NG2 抗体、兔抗大鼠GFAP及MBP抗体均为BD公司产品，胰蛋白酶为Invitrogen产品，多聚赖氨酸及多聚鸟氨酸为Sigma公司产品，rMIF及拮抗剂ISO-1 为Sigma公司产品，MTT试剂盒为Sigma公司产品。倒置相差显微 镜 (Olympus)、 荧 光 显 微 镜 (Leica)、 酶 标 仪 (Thermo labsysytems)。实验动物为清洁级6～8周龄C57B6 小鼠，雌雄不限，体质量18～25g。由第三军医大学第三附属医院(所)实验动物中心提供。

    1.2 混合胶质细胞的制备

    实验之前，先将D-Hanks液预冷，取5～8 mL于10 cm无菌培养皿里，并将培养皿放于冰上。取新生C57B6 小鼠(生后48 h内)，断颈处死后将头埋于冰中1～5min，然后浸入预冷的75%乙醇中消毒。将断头放入有预冷D-Hanks液的培养皿中清洗酒精，再将断头放入有预冷D-Hanks液的培养皿中，用镊子压住鼻部，沿图1 所示的虚线位置依次剪开新生小鼠脑皮肤、颅骨，取出脑组织，在解剖显微镜下用眼科镊依次剥除脑膜及血管，取大脑(剔除海马部分，如图1 所示)置于另一个有预冷D-Hanks液的培养皿中(1次可做5～10只新生小鼠) ......