毛镇伟 朱 灵 范 钰

    江苏大学附属人民医院肿瘤研究所，江苏镇江 212002

    大肠癌(包括结肠癌和直肠癌)近年来在我国发病率逐年增高。由于诊疗技术限制级人群忽视，很多患者发现时即有转移。转移的方式主要有血行转移、浸润种植、淋巴结转移等，主要转移至肝脏、淋巴结、肺部、脑部、及骨等部位。如何从分子水平进行大肠癌转移机制的研究，可为干预阻断大肠癌转移提供一定的理论基础。近年发现，骨桥蛋白(osteopontinin，OPN)与许多恶性肿瘤的侵袭转移的关系具有重要的相关性[1-2]。但是目前尚不完全清楚该基因在人大肠癌细胞侵袭过程中的机制。2012年1月～2012年6月，本课题组借助于 RNA 干扰(RNA interference，RNAi)技术，以大肠癌Colo205 细胞为模型，对其采用OPN基因小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)转染处理，探讨了对癌细胞生长和侵袭的作用，并从信号转导通路(Akt)方面探讨了分子机制。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    人大肠癌细胞Colo 205 购自美国ATCC公司，本院组织细胞生物库冻存。OPN基因siRNA的正义链序列：GAA ACU CCC UGU AAA CUA A dTdT；反义链序列：UAA GUU UAC AGG GAG UUU C dTdT，由美国Dharmacon公司合成。Akt及磷酸化抗体购自美国Santa Cruz公司。其他RNA提前试剂(Trizol，RNase 抑制剂)，和逆转录试剂(SSRTⅡ、Taq 酶)及转染试剂Oligofectamine购自美国Invitrogen公司。

    1.2 细胞培养及转染处理

    人大肠癌Colo 205 细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液，37℃、5%CO2、 饱和湿度环境的条件下连续培养。转染前1 天，将浓度为1.0 ×105/mL的细胞接种于24 孔培养板24 h后，待细胞长满60%～70%时进行转染。细胞分组：①空白对照组(Con-A)：未经任何处理的大肠癌细胞；②脂质体对照组(Con-B)；③错配siRNA体对照组(Con-C)；④不同浓度的siRNA组：10%胎牛血清的RPMI-1640 中含不同浓度 (6.25、12.5、25.0 nmol/L)的已用脂质体包埋的siRNA ......