王俊红 郭永红 张 静 徐 静 谢 璇 杨广笑 王全颖 王 枫

    1.西安交通大学医学院第二附属医院内分泌科，陕西西安 710004；2.第四军医大学营养与食品卫生教研室，陕西西安 710032；3.西安交通大学医学院第二附属医院感染科，陕西西安 710004；4.西安华广生物工程有限公司，陕西西安 710025

    Exendin-4是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体长效激动剂，具有与GLP-1相似的降血糖活性，目前已研发成为首个 “模仿肠降血糖素”治疗2型糖尿病的药物——Exenatide[1-2]。但是Exenatide需每日注射，对糖尿病患者的治疗很不方便[3]，并且天然Exendin-4的提取成本高，难以满足临床应用需要[4]，用基因工程方法生产前景广阔。由于Exendin-4缺乏模板，本实验利用重叠延伸PCR技术扩增出Exendin-4目的基因编码区DNA片段，成功构建了Exendin-4表达载体，为进一步利用腺相关病毒载体构建表达Exendin-4及研究其在糖尿病治疗过程中的分子作用机制奠定了基础。

    1 材料与方法

    1.1 质粒与菌株

    克隆载体 pGEM-T-Easy质粒(50 ng/μL)购自 Promega公司；大肠杆菌TOP10、E.coli DH5α菌株由西安华广生物工程公司提供。

    1.2 工具酶和主要试剂

    限制性内切酶NaeⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ及TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶等试剂购自华美生物工程公司；质粒小提试剂盒、PCR纯化试剂盒、DNA回收试剂、Marker等均购自北京天根公司；引物合成及测序由上海生物工程有限公司完成；其他试剂及全部实验设备均由西安华广生物工程公司提供。

    1.3 方法

    1.3.1 重叠延伸PCR扩增Exendin-4 cDNA[3]根据美国专利检索到Exendin-4氨基酸序列是39个氨基酸(sequence 1 from patent US 5424286 39aa) ......