张 旭 鹿 蕾 张 勉 张 婧 王艳丽 王美青

    第四军医大学口腔医学院解剖生理学教研室，陕西西安 710032

    用干细胞移植治疗疾病是当今医学研究的热点之一[1-2]，但移植后如何从受体辨别供体细胞，并观察其在活体内的生存迁徙情况，一直是困扰其临床应用的瓶颈之一[3]。超顺磁性纳米铁粒子(superparamagnetic iron nanoparticle，SPIO)可作为磁共振成像分子探针标记骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells，BMSCs)[3]，从而能够检测活体内细胞的迁徙、代谢和生物学行为。本实验以超顺磁性纳米铁粒子标记大鼠BMSCs，检测其对细胞生物学特性的影响并探讨不同浓度SPIO标记大鼠BMSCs的生物学特性和生命状态，为BMSCs的活体内示踪研究提供重要依据。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    以4周龄雌性SD大鼠(体重约120 g，由第四军医大学动物中心提供)为实验动物，主要试剂：DMEM/F12培养基、复合胶原酶 NB4、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶、纳米铁(由哈尔滨医科大学附属第四医院医学影像中心惠赠)、亚铁氰化钾、盐酸。主要仪器：倒置相差显微镜、JENM1220型透射电镜。

    1.2 SD大鼠BMSCs的分离培养与鉴定

    取大鼠双侧胫骨及股骨，用无血清DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，将冲洗获得的细胞悬液离心，取细胞沉淀，加入适量含10%胎牛血清的低糖型DMEM/F12培养基，置于5%CO2、37°C培养箱中培养。多次换液传代使BMSCs纯化，取第4代细胞进行爬片，4%多聚甲醛固定后行HE染色，光镜下观察。取培养的第5代细胞，吹打为单细胞悬液接种，进行细胞爬片。磷酸缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)洗去培养液，4%多聚甲醛固定15 min，以封闭液(PBS含1%牛血清白蛋白，0.1%Triton)室温下封闭30 min，加入兔抗小鼠 CD45，CD105，CD166，CD90 抗体 4°C 过夜后室温30 min，PBS洗涤3次，每遍5 min，然后以CY3联抗兔抗体室温下避光孵育 1 h，DAPI室温(1∶500)染核 5 min，PBS洗涤3次，每遍5 min，加荧光保护剂，激光共聚焦观察 CD45、CD105、CD166、CD90 的表达。

    1.3 SPIO标记BMSCs的制备与鉴定

    1.3.1 SPIO-BMSCs制备 ......