张捍军 张 睿 李华哲 赵承斌

    哈尔滨医科大学附属第四医院骨科，黑龙江哈尔滨 150086

    骨折是骨科临床中最为常见的疾病，特别是随着交通事故的频发，骨折患者的数量也呈逐年上升的趋势。目前，骨折的治疗方式主要包括切开复位和闭合复位，但无论哪种方式都存在延迟愈合甚至不愈合的可能，给患者的身心造成极大的痛苦。针对这一问题，国内外学者先后采用了机械固定、骨移植、电刺激、骨诱导等多种方法进行治疗[1-3]，虽然取得了一定的进展，但均不能完全解决骨折不愈合的难题。本研究采用与骨代谢密切相关的降钙素基因相关肽(CGRP)转染入骨折断端，观察其对骨折动物模型的愈合作用，在基因水平为促进骨折的愈合提供实验依据。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料

    36只 SD大鼠，平均体重(200±10)g，由中国农科院哈尔滨兽医研究所提供，许可证号：SYXK (黑)2006-032；pcDNA3.1-CGRP 质粒(Invitrogen，美国)，E.coli.DH5α(哈尔滨医科大学附属第四医院实验室提供)，CGRP引物、dNTP(TAKARA，日本)，Hind Ⅲ、BamHⅠ(博士德公司，中国武汉)，兔抗大鼠CGRP单克隆抗体、生物素二抗、AP二抗(博士德公司，中国武汉)。

    1.2 实验方法

    1.2.1 pcDNA3.1-CGRP质粒的转化 应用CaCl2溶液将E.coli.DH5α制备成感受态E.coli.DH5α，加入到 50 mL离心管中，向离心管中加入 5 μL pcDNA3.1-CGRP质粒，冰浴 30 min，42℃热休克 90 s，再冰浴 2 min。向管中加入SOC培养基800 μL，37℃培养 45 min，使恢复大肠杆菌的正常生长状态并且表达抗生素的抗性基因。将菌液涂于含有50 μg/mL氨苄青霉素的SOB平板上进行抗性筛选。

    1.2.2 CGRP的PCR及酶切鉴定 待菌落长出后，挑选饱满菌落对CGRP行PCR检测，向体系内加入5×PCR Buffer 4 μL，dNTP 1 μL，上下游引物各 1 μL(表1)，Taq DNA 聚合酶 0.2 μL，加 ddH2O 定容至 20 μL。 95℃变性 60 s，60℃复性 60 s，72℃延伸 60 s，30 个循环后，72℃延伸 5 min，4℃保温。对产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。对于PCR鉴定阳性菌落，扩增提取质粒后，加入 10×K Buffer 2 μL，Hind Ⅲ 1 μL，BamHⅠ1 μL ......