苗伏龙 刘 鹏 魏 明 张立军 于则利

    1.河北医科大学第一医院肝胆外科，河北石家庄 050031；2.河北医科大学第一医院普外科，河北石家庄 050031；3.首都医科大学附属北京同仁医院普外科，北京 100730

    近几十年来，肝细胞的实验和临床应用研究已经取得了卓越成就，尤其是在生物人工肝和肝细胞移植等方面，为肝脏疾病的治疗展现了诱人的前景[1-6]。随着对肝细胞需求的不断增加，寻找可以长期有效保存肝细胞的方法就迫在眉睫。此外，目前已有的研究表明合适的肝脏缺血预处理 (ischemic preconditioning，IPC)可以为肝脏缺血再灌注损伤提供有效的保护[7-19]。该实验正是利用缺血预处理对肝脏产生的这种保护机制，通过对不同时间缺血预处理的兔肝细胞存活率及功能情况的检测，探讨对兔肝脏进行适当时间的缺血预处理是否可以提高分离后肝细胞低温保存的效果，从而推动其在临床实践中的应用。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料

    1.1.1 实验动物与分组 军事医学科学院实验动物中心提供纯种雄性新西兰大白兔40只，3月龄，体重2～2.5 kg，随机分为 4 组：未预处理组(NPC)，5 min 缺血预处理组(IPC5)，10 min 缺血预处理组(IPC10)，15 min缺血预处理组(IPC15)。

    1.1.2 主要试剂仪器 电热恒温水浴箱为上海医用恒温设备厂生产，高速低温台式离心机为德国Eppendorf公司生产，4℃冰箱及-20℃冰箱为中国海尔生产，-80℃冰箱为日本 SANYO生产，Beckman SYNCHRON CX4CE型全自动生化分析仪为美国Beckman公司生产，Ⅳ型胶原酶、Hanks液、D-hanks液和台盼蓝购于美国Sigma公司，RPMI-1640培养液和胎牛血清购于美国Hyclone公司，二甲基亚砜(DMSO)购于德国Appliche公司。

    1.2 试验方法

    1.2.1 缺血预处理 术前禁食 12 h，20%乌拉坦以5 mL/kg耳缘静脉注射麻醉动物，腹部皮肤褪毛，常规消毒铺巾，腹正中切口进入腹腔，暴露并游离肝脏，分离出下腔静脉、门静脉和肝动脉，NPC组不行特殊处理；IPC5组为无损伤血管夹夹闭肝血供5 min，再复流5 min；IPC10组为无损伤血管夹夹闭肝血供10 min，再复流10 min；IPC15组为无损伤血管夹夹闭肝血供15 min，再复流 15 min。

    1.2.2 分离肝细胞 采用改良Seglen二步胶原酶灌注法分离肝细胞[20] ......