张 睿 张 军 赵承斌

    哈尔滨医科大学附属第四医院骨科，黑龙江哈尔滨 150086

    周围神经损伤是骨科常见的疾病之一，虽然周围神经具有一定的再生能力，但对于较大缺损却很难自身修复[1]。随着组织工程学领域研究的深入，神经干细胞 (NSCs) 已被公认为是对神经损伤修复的有效方法，通过NSCs 在神经断端的不断分化，使受损的周围神经重新恢复连接。然而单纯形态学得连接不能保证神经的传导功能，有研究表明，这与NSCs 分化过程中分化为胶质细胞和神经元的比例有关[2]，提高神经元的分化比例，降低胶质细胞的表达可有效提高神经的传导速度，因此许多学者通过不同方法促进神经干细胞向神经元的分化[3-5]，均取得了一定进展。 本研究通过激活态雪旺细胞(SCs)刺激NSCs 的分化，观察其诱导NSCs 分化为神经元的能力。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料

    雌性SD 大鼠[中国农科院哈尔滨兽医研究所提供，许可证号：SYXK(黑)2006-032]；DMEM/F12 细胞培养基(Hyclone 公司，美国)；青-链双抗，胰蛋白酶，Ⅱ型胶原酶 (碧云天， 中国)； 兔抗鼠单克隆抗体Nestin，FITC 标记的羊抗兔IgG，兔抗鼠碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)单克隆抗体，兔抗鼠MAP-2、GFAP 单克隆抗体(武汉博士德公司)；Transwell 培养皿(Corning 公司，美国)。

    1.2 实验方法

    1.2.1 神经干细胞的分离培养与鉴定 取出生24 h 内的SD 大鼠，断髓处死后无菌条件下取出脊髓，显微镜下剥离硬脊膜，剪成5 mm3组织块，加入0.25%胰酶消化10 min，用吸管反复吹打至单细胞悬液，加入5 mL DMEM/F12 培养基终止消化。 1000 r/min 离心5 min，弃上清，加入含20 ng/mL 的EGF 和20 ng/mL的DMEM/F12 培养液，重悬后移入细胞培养瓶，置于37℃含5%CO2的细胞培养箱中培养。 每6～8 天传代1次，连续传4 代。 取第4 代神经球，移入含有多聚赖氨酸包被的盖玻片的6 孔板内，24 h 后取出盖玻片，4%多聚甲醛固定，加入兔抗鼠Nestin(1∶100)单克隆抗体作为一抗，4℃过夜，加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔二抗，孵育30 min，进行观察。

    1.2.2 雪旺细胞的分离培养 取体重(100±5)g 的SD大鼠，10%水合氯醛3 mL/kg 腹腔麻醉后 ......