罗 劲 陈一强 孔晋亮 邬丽红 黄 宏

    广西医科大学第一附属医院呼吸疾病研究所，广西南宁 530021

    烟曲霉是导致临床免疫力低下患者肺部真菌感染的常见病原体之一。近年来虽然新型抗曲霉菌药物的研发取得了一定的进展，但唑类耐药和多重耐药菌株的出现，使烟曲霉感染的患者病死率依旧很高。体外研究发现，生物被膜形成是烟曲霉产生耐药的重要机制之一，且生物被膜一旦成熟，其耐药性将提高几十、几百甚至上千倍[1]，控制难治性烟曲霉感染成为当前临床治疗上面临的一大难题。因此若能够寻求一种能够有效破坏已经形成的烟曲霉生物被膜的药物或方法，或将有助于解决这一难题。金银花主要抗真菌活性成分为绿原酸和异绿原酸[2-3]，本课题组前期研究发现，绿原酸能破坏铜绿假单胞菌及烟曲霉生物被膜[4-5]，而目前异绿原酸对生物被膜相关生物学作用罕有报道，因此本实验旨在探究异绿原酸对不同时期烟曲霉生物被膜的体外作用，为控制生物被膜药物的研发在原料选择方面提供更多科学依据。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    收集广西医科大学第一附属医院(以下简称“我院”)2012年5月~2013年9月临床分离烟曲霉共31株，用结晶紫染色法测定成膜能力，选取成膜能力最强烟曲霉菌株(编号为A.f4)为实验菌株。质控菌株为近平滑念珠菌ATCC22019由我院临床微生物检验鉴定中心提供。

    1.2 主要试剂

    异绿原酸(中国食品药品检定研究院，批号111782-201204)以最大溶解度溶解于二甲基桠枫(DMSO，Solarbio公司)，0.22 μm 滤器滤过后于-20℃保存；结晶紫粉末(天津红岩试剂厂)溶解于灭菌去离子水配制成质量分数为1%的结晶紫染液；RMPI-1640粉(Gibico 公司)；3-(N-吗啉基)丙磺酸-4-吗啉丙磺酸(MOPS，美国 Sigma 公司)；LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability死活菌染色试剂盒(Invitrogen公司)；马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA，中国路桥技术责任有限公司)；分析纯无水乙醇(天津Kermel化学试剂有限公司)；磷酸盐缓冲液(PBS)粉(美国 sigma公司)。

    1.3 仪器

    圆形玻璃细胞爬片(直径13 mm，天津博泰克科技公司)作为构建生物被膜的载体，高压灭菌备用；生物安全柜(苏州净化设备有限公司BHC-1300IIA/B2)；智能生化培养箱(常州市伟嘉仪器制造有限公司 SPX250)；酶标仪(美国 Thermo Multiskan MK3)；扫描电镜(日立SU8020)；激光共聚焦显微镜(CLSM ......