朱世振 邱 波▲ 高明勇 宋其合 门海龙

    1.武汉大学人民医院骨科，湖北武汉 430060；2.湖北省新华医院骨科，湖北武汉 430060

    骨关节炎(osteoarthritis，OA)是以关节软骨细胞凋亡和细胞外基质进行性降解为主要病理特征的疾病。OA 的病因尚不完全清楚，研究证实OA 受累软骨和滑膜中已发现多种血管生成介质，其中血管内皮生长子(vascular endothelia growth factor，VEGF)是血管生成的主要调节因子，探讨VEGF 在关节软骨中退变的作用，特别是以VEGF 为靶向的骨关节炎疾病的治疗是研究的热点之一。本实验探讨VEGF 对软骨细胞凋亡，以及对增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)表达和一氧化氮(nitric oxide，NO)含量的影响，为今后以VEGF 为靶点治疗骨关节炎提供新思路。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料

    武汉大学医学部实验动物中心提供的出生1 周龄的SD 级乳鼠10 只，雌雄不分，体重(100±10)g。DMEM/F12 培养基(Gibco)，胎牛血清(美国Hyclone公司)，胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶(美国Sigma 公司)，细胞总蛋白提取试剂盒(武汉谷歌生物)，PCNA 一抗，Annexin-FITC 细胞凋亡试剂盒，NO 检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

    1.2 实验方法

    1.2.1 软骨细胞的体外培养和分离 将乳鼠处死后，75%乙醇浸泡，取其膝关节软骨，并无菌条件下移至加有10%胎牛血清的培养基中， 剪碎至1 mm3大小，依次用0.25%胰蛋白酶37℃消化40 min，1000 r/min离心5 min 后，弃上清，用PBS 洗3 遍，再加入0.2%Ⅱ型胶原酶，37℃消化2 h，细胞接种于DMEM/F12 培养基， 并补充100 mL/L 胎牛血清，100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素， 密度为2×105接种于培养板，置于CO2培养箱中培养，待细胞70%～80%融合后，培养基中分别加入不同干预因素。实验分三组，对照组：不加任何处理因素；VEGF 组：10 ng/mL VEGF；C 组：10 ng/mL IL-1β，每组设4 个复孔，连续培养48 h 进行检测。

    1.2.2 流式细胞技术检测软骨细胞凋亡 用0.25%胰酶将各组贴壁细胞从培养板上消化并分别收集至2 mL EP 管中，将各组细胞用1 mL PBS 洗涤一遍 ......