张小艺 孟红艳 彭 敏 司 皓 马宏博

    1.山东大学附属省立医院中医科，山东济南 250021；2.山东大学公共卫生学院，山东济南 250012

    内毒素(lipopolysaccharide，LPS)是导致急性肺损伤(acute lung injury，ALI)的重要因素，Toll 样受体(Toll like receptor，TLR)是LPS 信号向细胞内传导的“门户蛋白”[1]， 其信号通路的过度激活是导致炎性反应爆发失控的重要机制。 TLR4 可以选择性识别LPS，LPS 与单核巨噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞细胞膜上的TLR4 结合，引起炎症瀑布效应[2]。 调节TLR4 信号通路有可能成为脓毒症的一种治疗策略[3]。

    RNA 干扰(RNA interference，RNAi)近年来取得相当大的进展，研究人员利用RNAi 作为研究工具引入到细胞或整个生物RNAi 试剂，用以识别新的细胞通路和潜在的药物靶点[4]。 慢病毒载体是一种高效率的转基因和基因治疗工具，其最大优势在于能够感染分裂和静止状态下的细胞，并且能够高效、稳定地整合于宿主细胞内[5]。 本实验通过构建TLR4 siRNA 慢病毒载体，转染至大鼠巨噬细胞NR8383，并通过实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测TLR4 siRNA 干扰的效果，为进一步探讨TLR4 信号通路在ALI 发生、发展中的机制提供研究工具。

    1 材料与方法

    1.1 材料与试剂

    聚合酶链反应(PCR)反应试剂，Primer(R＆F)合成、dsDNA oligo、293T 细胞株、大肠埃希菌菌株DH5α、病毒载体均由上海吉凯基因化学技术有限公司提供；Taq 酶、SYBR Master Mixture 购于TaKaRa；Age Ⅰ、EcoRⅠ、T4 DNA ligase、T4 DNA ligase buffer 来 自 于NEB；QIAGEN Plasmid 大抽Kit 来自QIAGEN；Rnase Inhibitor、dNTP、M-MLV 逆转录酶购于Promega；Lipofectamine 2000、Trizol 购 自Invitrogen；ECL-PLUS/Kit购于Amersham 公司；positive clone 测序由上海美季生物技术有限公司完成；胎牛血清、DMEM 购自Gibco公司；Opti-MEM 购自Invitrogen。

    1.2 方法

    1.2.1 TLR4 基因RNAi 慢病毒载体构建 ......