邓印根 张志杰 卢敏莹 贾小婷 彭 聪 贺智敏广州医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所 广州市恶性肿瘤治疗转化医学重点实验室，广东广州 510095

    鼠源乳腺癌多药耐药细胞株的建立及耐药机制的初步研究

    邓印根张志杰▲卢敏莹贾小婷彭聪贺智敏

    广州医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所广州市恶性肿瘤治疗转化医学重点实验室，广东广州510095

    目的 构建鼠源性乳腺癌5-氟尿嘧啶(5-Fu)耐药细胞株，为研究乳腺癌耐药与体内免疫微环境的关系提供细胞模型。方法 通过体外以浓度递增的方法诱导小鼠乳腺癌4T1细胞对5-Fu产生耐药，MTS法确定其耐药性，平板克隆检测其增殖活性，实时定量和半定量PCR检测其中5-Fu代谢相关酶TS、MTHFR、TK、OPRT、DPD及药泵蛋白MDR1、MRP1的表达，通过流式细胞术检测其周期及CD44+CD24-干细胞亚群的比例。 结果 耐药细胞4T1/5-Fu与4T1细胞相比，4T1/5-Fu细胞对5-Fu、吉西他滨和顺铂耐药的耐药指数(RI)明显升高；5-Fu合成代谢相关酶TK、OPRT表达明显降低 (P1 材料与方法

    1.1材料

    小鼠乳腺癌细胞系4T1为广州医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所冻存保存，购自上海生命科学院细胞库。培养基RPMI-1640、0.25%胰酶、胎牛血清和TRizol购自美国Invitrogen公司。MTS、逆转录试剂盒及Taq酶购自美国Thermo公司，SYBR Green qPCRMaster Mix购自美国Fermentas生物公司，引物由中国上海Invitrogen合成。PI染料购自美国BD公司。抗鼠FITC-CD44、APC-CD24单克隆抗体购自美国Ebioscience公司。

    1.2方法

    1.2.1细胞培养及5-Fu耐药细胞株建立4T1乳腺癌细胞采用RPMI-1640(含有10%胎牛血清)培养液，在37℃、5%CO2条件下于培养箱中培养，每2～3天更换培养液，用0.25%胰蛋白酶消化传代。实验时取对数生长期细胞。以浓度递增的方法建立4T1/5-Fu耐药细胞株。5-Fu起始浓度为1 ng/mL，最后直到细胞在含5-Fu 100 ng/mL培养基中呈指数生长，历时12个月，得到耐药细胞系命名为4T1/5-Fu。

    1.2.2细胞药物敏感性实验(MTS)收集对数生长期细胞，计数，接种于96孔培养板中，于37℃、5%CO2培养箱中培养过夜。24 h后加入不同浓度的药物处理细胞，置于培养箱中孵育48 h后，每孔加入MTS(5 g/L)20μL ......