吕典一 武付霞 陈凤仪

    [摘要] 目的 探討miR-145下调靶基因ACVR1B促进急性川崎病(KD)的病理进程。 方法 回顾性分析宜昌市第一人民医院2015年11月～2018年6月收治的108例KD患儿的病历资料，根据病情将其分为4组，KD急性组为确诊的KD急性期患儿28例，KD康复组为同期入院进行治疗后康复期的儿童24例，发热对照组为急性上呼吸道感染的发热患儿30例，正常对照组为同期健康体检者26名。分别抽取其血清检查miR-145的表达水平。进行靶基因数据库、荧光素酶报告基因法、qRT-PCR及Western blot等相关检验。 结果 KD急性组白细胞计数、C反应蛋白和红细胞沉降率均显著高于正常对照组(P 0.05)，具有可比性。见表1。

    1.2 方法

    1.2.1 血清采集 抽取所有对象的清晨空腹外周静脉血：采用一次性血清分离胶管，抽取外周静脉血约3 mL；待血清析出后以1000 g离心10 min，取上层血清保存至-80℃冰箱待检测[6]。

    1.2.2 qRT-PCR检测血清miR-145和ACVR1B的表达 取0.5 mL血清标本，采用Trizol法提取血清总RNA，实验步骤按照Trizol试剂盒说明书进行。将提取到的总RNA按照反转录试剂盒的说明书进行RNA逆转录，合成cDNA。按照qRT-PCR试剂盒说明书进行进行PCR反应。

    1.2.3 细胞培养 取急性KD合并冠脉并发症患儿的冠状动脉组织标本，0.25%胰蛋白酶消化，待细胞分散后，过滤收集HCAEC细胞。取HCAEC细胞，在含10%胎牛血清的培养基中于37℃，5%的CO2的培养箱中常规培养，再用2.5%的胰蛋白酶每2天进行消化，传代，并取对数生长期细胞用于实验。

    1.2.4 细胞转染 取对数生长期HCAEC细胞(1～1.5)×106个分板，接种于6孔板中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养至细胞密度60%～70%时，将细胞分为3组：miR-145 mimics转染组，转染miR-145 mimics；miR-145 mimics+ACVR1B转染组，转染miR-145 mimics和ACVR1B；对照组，转染negative control miRNA mimics (miR-NC)。将培养基换为无血清无双抗的培养基，每孔1 mL，miRNA及转染试剂Lipofectamine 2000分别用100 μL OMEM稀释后，依照说明书所需比例混匀后静置20 min后 ......