葛凌 陈何健 徐航娣

    [摘要] 目的 探究miR-501在吉非替尼耐药非小细胞肺癌(NSCLC)中的作用和机制。 方法 采用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测吉非替尼耐药性NSCLC血清和细胞系PC9/GR中miR-501的表達水平，通过CCK-8、划痕实验和Transwell实验检测miR-501对PC9/GR的恶性表型的影响;利用在线数据库预测miR-501的潜在靶点，并验证其在PC9/GR的具体作用。 结果 与健康对照人群和正常人肺上皮细胞系比较，miR-501在吉非替尼耐药性NSCLC患者血清和PC9/GR中表达水平升高，差异有高度统计学意义(P 0.05)，具有可比性，见表1。受试对象均被告知本试验的研究目的，并签署知情同意书。涉及的操作经我院医学伦理委员会批准。

    表1 ? 三组一般资料比较

    1.2 细胞系

    正常人肺上皮细胞系BEAS-2B、人NSCLC细胞系PC9和人胚胎肾细胞系HEK-293T均购于美国ATCC公司;吉非替尼耐药性PC9细胞系PC9/GR由PC9细胞系构建，保存于温州医科大学科研实验中心。

    1.3 试剂与仪器

    胎牛血清FBS(货号：10099)、RPMI-1640培养基(货号：12633012)和DMEM培养基(货号：12491015)购于美国Gibco;miRNeasy Serum/Plasma试剂盒(货号：217184)和miRNeasy Mini试剂盒(货号：217004)购于德国Qiagen;SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒(货号：DRR081A)购于日本Takara;引物、miR-501 mimics、BLID过表达质粒、载有野生型BLID和突变型BLID的载体pGL3购于中国生工;Lipofectamine 3000(货号：L3000015)购于美国Invitrogen;吉非替尼(货号：SML1 657)购于美国Sigma-Aldrich;CCK-8试剂盒(货号：C0038)、RIPA裂解液(货号：P0013B)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号：P0012)、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(货号：P0012A)、小鼠抗GAPDH单克隆抗体(货号：AF0006)和辣根过氧化物酶耦合二抗(货号：A0208、A0216)购于中国碧云天;Transwell小室(货号：354480)购于美国CORNING;PVDF膜(货号：IPVH00010)购于美国Millipore;兔抗BLID多克隆抗体(货号：ab230129)购于美国Abcam;荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号：G7940)购于美国Promega;倒置显微镜(IXplore Standard)购于日本奥林巴斯;实时定量PCR仪(CFX384 TouchTM)、电泳转膜仪(Mini-PROTEAN？誖 Tetra Cell)、化学发光仪(ChemiDoc XRS+)和酶标仪(iMark)购于美国Bio-Rad ......