脑苷肌肽对穹窿海马伞横断痴呆鼠学习记忆的影响(1)
[摘 要] 目的探讨脑苷肌肽是否有益于阿尔茨海默病的治疗及可能的机理。方法横断穹窿海马伞制作痴呆模型，术后皮下注射脑苷肌肽0.4ml/(kg·d)连用15d。水迷宫试验检测大鼠空间探索和记忆能力。检测大鼠基底前脑胆碱能神经元和海马胆碱能神经纤维。结果痴呆模型组与正常组相比，平均逃避潜伏期和原平台象限的游泳距离占总游泳距离的百分比均明显减少，基底前脑胆碱能神经元和海马胆碱能神经纤维明显减少；治疗组与痴呆组相比，平均逃避潜伏期和原平台象限的游泳距离占总游泳距离的百分比均显著上升，基底前脑胆碱能神经元和海马胆碱能神经纤维显著增加。结论脑苷肌肽明显改善横断穹窿海马伞所致痴呆模型空间探索和记忆能力，其作用通过减少基底前脑胆碱能神经元的丢失和增加海马胆碱能纤维而实现。
[关键词] 神经节苷脂；阿尔茨海默病；学习；记忆
阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)是一种进行性神经退行性疾病，老年发病率高，临床主要表现为记忆力减退，定向障碍和判断推理能力受损等。脑苷肌肽含有多种神经节苷脂(MonesialotetrahexosyI ganglioside，GM)，GM是位于细胞膜表面的一组含唾液酸的糖鞘脂，可促进损伤后神经结构的修复，改善中枢神经系统受损的功能。本实验采用切断穹窿海马伞制作AD模型，观察脑苷肌肽对AD模型大鼠学习和认知能力的治疗作用，探讨脑苷肌肽对学习和认知影响的可能机制。
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1 材料与方法
1.1 药品与动物脑苷肌肽购于威威润生有限公司，胆碱乙酰转移酶(chAT)抗体、乙酰硫代胆碱、ABC试剂盒均购于Sigma公司。健康4个月龄雄性sD大鼠共30只，体质量200～250 g不等，由辽宁医学院提供。
1.2 实验动物分组及模型制作将大鼠随机分为3组：①AD模型组(12只)：1%戊巴比妥钠(40 m#kg)腹腔麻醉下，俯卧固定于立体定位仪上。参照Paxino和Waston大鼠大脑定位图谱，以前囟为0点，选出进刀坐标：前后(AP)为1.8mm，外侧(L)为2.5mm，腹侧(V)为5.5mm。开颅后，用自制双刃刀片(宽1.0mm)按照上述坐标缓慢插入脑组织，上下移动10次，然后向中线移动1.0mm，再上下移动10次，依次横向切断双侧穹窿海马伞。②治疗组(12只)：术后皮下注射脑苷肌肽0.4ml/(kg·d)，连用15d。③正常对照组(6只)：皮下注射同等体积的生理盐水。
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1.3 Moms水迷宫实验
1.3.1 定位航行试验(Place navigation)实验前1天，让大鼠在水池自由游泳2min，熟悉水迷宫环境。第2天开始正式训练，历时5d，每天分上、下午2个时段，每段时间训练4次，分别从水池的东、南、西、北四点入水，观察并记录大鼠找到平台并爬上平台所需时间，即逃避潜伏期(Escape latch-cy)。如大鼠在2min内找不到平台，则由实验者将其引向平台，其潜伏期位120sec。每次训练间隔位30～60 see。
1.3.2 空间探索试验(spatial probe test)于实验第5天，撤走平台，任选一个人水点，将大鼠放入水中，通过录象机记录大鼠在2min 内的游泳轨迹，并计算大鼠在原平台象限的游泳距离占总游泳距离的百分比，以此作为判断大鼠的记忆力。
1.4 形态学观察及分析
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1.4.1 组织切片制备于水迷宫测试结束后第2天将动物处死，经左心室升主动脉插管，生理盐水冲洗，4%多聚甲醛(4℃)灌注固定30～45 min。开颅取脑，以同样的固定液固定16～24 h，入30%蔗糖缓冲液24h，半导体冰冻切片机上进行连续切片，片厚40μm，取基底前脑和海马出现被侧连接的切片2套，分别用于ChAT和乙酰胆碱酯酶(AchE)染色。
1.4.2 ChAT免疫组化反应参照c.Zimmer和Kalman的染色过程，用ABC法染色，程序为：切片以0.01 M PBS(pH7.4)洗后加入含O.3%Tritonx-100的1%牛血清白蛋白中30 rain；切片入ChAT单克隆抗体(1：500)室温1h，然后转入4℃冰箱过夜；次日先以0.01M PBS洗3 x10min，再人生物素结合的IgG(1：200)，37℃温箱孵育2 h；0.01M PBS洗3×10min后人生物素一卵蛋白一辣根过氧化物复合物(1：200)，37℃温箱孵育2h；0.01M PBS洗3×10 min，入含O.01%过氧化氢、O.05% 氨基联苯胺混合液中显色5～10 min；PBS洗后风干、脱水、透明、中性树胶封片。
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1.4.3 AchE组织化学反应采用Hedreen等推荐的AchE组织化学方法。切片经0.1M 醋酸缓冲液(pH6.0)冲洗2次入碘化乙酰硫代胆碱孵育，室温60min；0.1M 醋酸缓冲液冲洗5次，l min/次；入1%硫化胺反应1min；0.1M 硝酸钠冲洗5次，贴片、风干、脱水、透明、中性树胶封片。
1.5 数据获取与统计分析
1.5.1 ChAT阳性细胞的分析光镜下(物镜10×)选取每只大鼠基底前脑含有典型内侧隔核和斜角带核垂直支切片6张，记录ChAT阳性细胞数，并计算损伤侧占正常侧细胞数百分比。用Student-Newman Kaels方法进行统计分析。
1.5.2 AchE阳性纤维数的分析光镜下(物镜40×)选取每只大鼠含典型背侧海马的AchE阳性切片6张，通过镜内测试方格(O.01 mm(H2))选取每张切片CAl区辐射层和齿状回分子层各3个视野，记录损伤侧及正常侧阳性纤维与测试格线交叉点数，计算损伤侧AchE阳性纤维占正常侧百分比，用相同方法进行统计学分析。
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2 结果
2.1 学习和认知能力检测
2.1.1 定位航行试验正常对照组、AD模型组和治疗组大鼠平均逃避潜伏期比较见图1。正常对照组平均逃避潜伏期(26.52±2.45)sec。AD模型组为(65.47±2.88)sec，治疗组为(30.59±3.12)sec，AD模型组与正常对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。
2.1.2 空间探索试验正常对照组、AD模型组和治疗组大鼠平台象限游泳距离占总距离百分比见图2。正常对照组大鼠平台象限游泳距离占总距离为36%，AD模型组为21%，治疗组为34%，AD模型组与正常对照组比较有统计, http://www.100md.com(宁 一 童健尔 刘学政)
[关键词] 神经节苷脂；阿尔茨海默病；学习；记忆
阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)是一种进行性神经退行性疾病，老年发病率高，临床主要表现为记忆力减退，定向障碍和判断推理能力受损等。脑苷肌肽含有多种神经节苷脂(MonesialotetrahexosyI ganglioside，GM)，GM是位于细胞膜表面的一组含唾液酸的糖鞘脂，可促进损伤后神经结构的修复，改善中枢神经系统受损的功能。本实验采用切断穹窿海马伞制作AD模型，观察脑苷肌肽对AD模型大鼠学习和认知能力的治疗作用，探讨脑苷肌肽对学习和认知影响的可能机制。
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1 材料与方法
1.1 药品与动物脑苷肌肽购于威威润生有限公司，胆碱乙酰转移酶(chAT)抗体、乙酰硫代胆碱、ABC试剂盒均购于Sigma公司。健康4个月龄雄性sD大鼠共30只，体质量200～250 g不等，由辽宁医学院提供。
1.2 实验动物分组及模型制作将大鼠随机分为3组：①AD模型组(12只)：1%戊巴比妥钠(40 m#kg)腹腔麻醉下，俯卧固定于立体定位仪上。参照Paxino和Waston大鼠大脑定位图谱，以前囟为0点，选出进刀坐标：前后(AP)为1.8mm，外侧(L)为2.5mm，腹侧(V)为5.5mm。开颅后，用自制双刃刀片(宽1.0mm)按照上述坐标缓慢插入脑组织，上下移动10次，然后向中线移动1.0mm，再上下移动10次，依次横向切断双侧穹窿海马伞。②治疗组(12只)：术后皮下注射脑苷肌肽0.4ml/(kg·d)，连用15d。③正常对照组(6只)：皮下注射同等体积的生理盐水。
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1.3 Moms水迷宫实验
1.3.1 定位航行试验(Place navigation)实验前1天，让大鼠在水池自由游泳2min，熟悉水迷宫环境。第2天开始正式训练，历时5d，每天分上、下午2个时段，每段时间训练4次，分别从水池的东、南、西、北四点入水，观察并记录大鼠找到平台并爬上平台所需时间，即逃避潜伏期(Escape latch-cy)。如大鼠在2min内找不到平台，则由实验者将其引向平台，其潜伏期位120sec。每次训练间隔位30～60 see。
1.3.2 空间探索试验(spatial probe test)于实验第5天，撤走平台，任选一个人水点，将大鼠放入水中，通过录象机记录大鼠在2min 内的游泳轨迹，并计算大鼠在原平台象限的游泳距离占总游泳距离的百分比，以此作为判断大鼠的记忆力。
1.4 形态学观察及分析
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1.4.1 组织切片制备于水迷宫测试结束后第2天将动物处死，经左心室升主动脉插管，生理盐水冲洗，4%多聚甲醛(4℃)灌注固定30～45 min。开颅取脑，以同样的固定液固定16～24 h，入30%蔗糖缓冲液24h，半导体冰冻切片机上进行连续切片，片厚40μm，取基底前脑和海马出现被侧连接的切片2套，分别用于ChAT和乙酰胆碱酯酶(AchE)染色。
1.4.2 ChAT免疫组化反应参照c.Zimmer和Kalman的染色过程，用ABC法染色，程序为：切片以0.01 M PBS(pH7.4)洗后加入含O.3%Tritonx-100的1%牛血清白蛋白中30 rain；切片入ChAT单克隆抗体(1：500)室温1h，然后转入4℃冰箱过夜；次日先以0.01M PBS洗3 x10min，再人生物素结合的IgG(1：200)，37℃温箱孵育2 h；0.01M PBS洗3×10min后人生物素一卵蛋白一辣根过氧化物复合物(1：200)，37℃温箱孵育2h；0.01M PBS洗3×10 min，入含O.01%过氧化氢、O.05% 氨基联苯胺混合液中显色5～10 min；PBS洗后风干、脱水、透明、中性树胶封片。
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1.4.3 AchE组织化学反应采用Hedreen等推荐的AchE组织化学方法。切片经0.1M 醋酸缓冲液(pH6.0)冲洗2次入碘化乙酰硫代胆碱孵育，室温60min；0.1M 醋酸缓冲液冲洗5次，l min/次；入1%硫化胺反应1min；0.1M 硝酸钠冲洗5次，贴片、风干、脱水、透明、中性树胶封片。
1.5 数据获取与统计分析
1.5.1 ChAT阳性细胞的分析光镜下(物镜10×)选取每只大鼠基底前脑含有典型内侧隔核和斜角带核垂直支切片6张，记录ChAT阳性细胞数，并计算损伤侧占正常侧细胞数百分比。用Student-Newman Kaels方法进行统计分析。
1.5.2 AchE阳性纤维数的分析光镜下(物镜40×)选取每只大鼠含典型背侧海马的AchE阳性切片6张，通过镜内测试方格(O.01 mm(H2))选取每张切片CAl区辐射层和齿状回分子层各3个视野，记录损伤侧及正常侧阳性纤维与测试格线交叉点数，计算损伤侧AchE阳性纤维占正常侧百分比，用相同方法进行统计学分析。
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2 结果
2.1 学习和认知能力检测
2.1.1 定位航行试验正常对照组、AD模型组和治疗组大鼠平均逃避潜伏期比较见图1。正常对照组平均逃避潜伏期(26.52±2.45)sec。AD模型组为(65.47±2.88)sec，治疗组为(30.59±3.12)sec，AD模型组与正常对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。
2.1.2 空间探索试验正常对照组、AD模型组和治疗组大鼠平台象限游泳距离占总距离百分比见图2。正常对照组大鼠平台象限游泳距离占总距离为36%，AD模型组为21%，治疗组为34%，AD模型组与正常对照组比较有统计, http://www.100md.com(宁 一 童健尔 刘学政)