维生素E对继发性脊髓损伤保护作用的实验研究(1)
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【摘要】 目的 探讨维生素E对兔急性脊髓损伤(ASCI)保护作用的机制。方法 新西兰大白兔51只，随机分为3组，A组：正常组，B组：ASCI组，C组：ASCI+维生素E处理组。3%戊巴比妥钠(1 ml/kg)腹腔注射麻醉，常规消毒铺巾，显露L1-3棘突及椎板，显露硬膜。A组在显露硬膜后予以止血后缝合伤口。B、C组按改良的Allen’s重物打击法制备ASCI模型，在急性脊髓损伤后30 min，给B组腹腔注射生理盐水1 ml/kg，C组腹腔注射维生素E10 mg/kg。48 h后每组随机抽取10只动物处死，以打击处为中心切取伤段脊髓0.8 cm长，将标本从中间分两半，一半常规HE染色，光镜下观察其组织学形态改变，另一半作水量测定。每组2只兔经灌流固定后，取损伤段脊髓常规制作透射电镜标本。于两星期后观察3组剩余5只动物行为学指标。数据进行统计学分析。结果 各损伤段脊髓含水量均高于正常对照组(P[1]。继发性损伤是脊髓原发性损伤之后由于各种因素引起的脊髓再损伤，所产生的脊髓损害远远超过了原发性损伤[2]。本实验通过Allen’s重物坠落(weight drop WD)法模型，探讨维生素E对ASCI 的保护作用，为临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康新西兰大白兔51只，均为24周龄以上，雌雄不限，体重2.5~3.0 kg(平均2.8 kg)，白求恩国际和平医院实验动物中心提供，采用标准饲料，饮用自来水。
1.2 动物分组 随机分为3组，每组17只，A组：正常组，B组：急性脊髓损伤组，C组：急性脊髓损伤+维生素E处理组。
1.3 模型制备 51只兔术前禁食过夜，自由饮水，背部正中手术区脱毛。3%戊巴比妥钠(1 ml/kg)腹腔注射麻醉，麻醉效果满意后，将动物俯卧位固定于手术台上。手术区常规消毒，铺盖无菌手术单，以L2为中心行后正中切口3 cm，显露L1-3棘突及椎板，切除棘突、椎板及黄韧带，造成一长约1 cm，宽约0.5 cm骨窗，显露硬膜。A组在显露硬膜后予以止血后缝合伤口。B、C组按改良的Allen’s重物打击法制备急性脊髓损伤模型。将自制的铜制薄垫片(8 mm×4 mm×0.5 mm)平放于硬膜上，用自制的30 g重的钢棒在玻璃管的引导下行重力打击，打击强度由预实验确定，为30×9(g·cm)，打击完毕后冲洗止血，逐层缝合伤口，在急性脊髓损伤后30 min，给B组腹腔注射生理盐水1 ml/kg，C组腹腔注射维生素E10 mg/kg。术后置于恒温箱内饲养，标准饮食，自由饮水、活动，人工排尿，每日腹腔注射青霉素15万U/(kg·d)，C组腹腔注射维生素E20 mg/(kg·d)，B组腹腔注射生理盐水2 ml/(kg·d)。每日密切观察四肢活动情况，无感染及死亡患者。
1.4 取材 48 h后随机每组随机抽取10只动物用耳缘静脉栓塞法处死，于原切口显露脊髓，以打击为中心取伤段脊髓0.8 cm长，将标本从中间分两半，一半作组织学检查，用10%中性福尔马林固定，另一半作水含量测定。先用生理盐水将其表面血液冲净，再用显微器械轻柔去除硬膜，滤纸吸干水分后装于瓶中称重，置于-20°C冰箱备用。
1.5 组织水含量测定 将冻存标本取出，于电烤箱(100°C)放置24 h烤干称重，按Elliot公式计算含水量：组织含水量＝(湿重-干重)/湿重×100%。
1.6 组织病理学检查 标本经固定包埋染色等程序后光镜下观察其组织学形态改变。
1.7 电镜观察 每组2只兔经灌流固定后，于损伤中心切取电镜标本，迅速切成1 mm3的小块后置于3%戊二醛中固定，经固定脱水包埋切片后，醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色，在日立H-7500透射电镜下观察，拍照片。
1.8 行为学指标(采用盲法观察) 于两星期后对每组剩余5只动物进行盲法观察，并进行行为学评分。斜板试验：以Molt斜板测量动物在斜板上维持5 s不下滑的最大角度。
1.9 统计分析 数据采用SPSS12.0统计软件进行结果分析，水含量、行为学指标以均数±标准差(x±s)表示，比较用单因素方差及t检验进行统计学处理。
2 结果
2.1 伤段脊髓组织含水量比较 各损伤组伤段脊髓含水量均高于正常对照组(P
2.2 HE染色 正常组(图2-3)脊髓灰白质界限清楚，神经元及髓鞘形态结构正常。神经元细胞核细长呈波浪状，两头较尖，胶质细胞散在、均匀分布。损伤组(图4-5)灰白质边界不清，可见大片状出血、水肿、坏死区，灰质中神经元减少，部分尼氏小体及细胞核消失，白质呈网状脱髓鞘。神经元细胞消失，可见大量胶质细胞明显增生，核圆形，较大，深染。维生素E治疗组(图6-7)脊髓组织出血、水肿、脱髓鞘明显轻于非维生素E治疗组。神经元细胞核轻度变性，胶质细胞轻度增生，神经纤维偶见。
2.3 透射电镜观察结果 B组脊髓灰质内神经细胞核不完整，核膜模糊，变形，核仁内有空泡形成，线粒体肿胀，嵴消失，内质网扩张，核糖体减少，后索髓鞘板层结构排列紊乱，扭曲变形，轴索内结构不清晰。C组结构破坏明显轻于B组，细胞核尚完整，细胞器变性改变轻，后索髓鞘板层结构尚存，轴索内可见肿胀的线粒体及微丝、微管。
正常组 (图8-9)神经元细胞膜完整，细胞器丰富，无破坏，髓鞘板层结构规整，微丝微管清晰可见。损伤组(图10)有髓神经体积变大，髓索高度水肿，线粒体和微丝微管数量显著减少，线粒体空化明显，髓鞘变得菲薄。损伤组(图11)神经元细胞膜完全破裂消失，线粒体部分或大部分脊和膜融合或破损消失，粗面内质网扩张，呈池状，脱颗粒现象严重。治疗组(图12)有髓神经髓鞘增生增厚，厚薄不均，排列紊乱，形状不规整，髓索内可见大量的线粒体和微丝微管。治疗组(图13)粗面内质网轻度扩张，有脱颗粒现象。
2.4 行为学评分 各损伤组行为学评分斜板维持角度均低于正常组(P[1]。原发性损伤是指受伤时由于骨折的移位、脱位引起椎间盘脱入椎管及骨折片刺入脊髓而造成的急性脊髓压迫、冲击、撕裂、挫裂及剪切伤，是在受伤的一瞬间由外力产生的决定性的、不可逆的损伤，无法对其损伤机制进行有效的治疗。继发性损伤是(关 浩)