氯化钆诱导大鼠腹腔巨噬细胞内质网应激和凋亡的研究(2)
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1.1.2 PMΦ给药方案 将PMΦ培养至第7 d,细胞融合达到80%时进行给药处理。试验分为正常对照组、GdCl3组、Tunicamycin组。①正常对照组:分为两组,每组细胞分别加入与② 、③组等量的生理盐水与DMSO溶媒。②GdCl3组:精密称取GdCl3.6H2O晶体7.9 mg溶于生理盐水,充分溶解后过滤除菌,得5×10-3M的母液,取母液4 μl加入4 ml DMEM中,混匀后换液,每孔加1 ml,培养24 h后处理。③Tunicamycin组:取用DMSO配制的2.5 mg/ml的母液用DMEM按1:1000稀释,每孔加1 ml,培养4 h后处理。以上各组均设四个复孔。
1.2.3 细胞免疫化学 PBS摇洗10 min×2次,用预冷的4%多聚甲醛4℃固定30 min, 再用含0.1% BSA+0.1%皂角素的PBS,4℃封闭30 min。每孔滴加一抗(ARMET,1:20,用含0.1% BSA+0.1%皂角素的PBS稀释)100 μl,4℃孵育过夜。次日PBS洗后滴加带HRP标记的猪抗兔二抗(1:100)37℃孵育1 h,DAB显色,苏木素复染,盐酸酒精分色,蓝化,滴加DAPI染核, PBS洗10 min×2次后, 荧光显微镜下观察,摄像。
1.2.4 免疫化学阳性细胞计数 在DAB显色的细胞组织化学玻片上,用高倍镜(×400)每孔随机取五个视野计数阳性细胞,每组按四孔计数,求出阳性细胞的百分数,并以(x±s)表示。
1.2.5 细胞免疫荧光双标染色 PBS摇洗10 min×2次,用预冷的4%多聚甲醛4℃固定30 min, 再用含0.1% BSA+0.1%皂角素的PBS,4℃封闭30 min。滴加两种一抗,4℃孵育过夜。次日用PBS洗后滴加1:500稀释的两种荧光标记二抗,37℃避光孵育1 h ......
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