酒精诱导肝癌细胞BEL-7402凋亡的作用研究
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【摘要】 目的 体外观察不同浓度的酒精对肝癌细胞BEL-7402诱导凋亡的作用，为寻求肝癌的治疗提供新思路。方法 不同浓度的酒精与肝癌细胞BEL-7402通过体外培养，MTT法检测细胞增殖的变化；Hoechst 33258/PI 荧光双染色观察细胞形态学变化；蛋白质免疫印迹(Western blotting)半定量分析Caspase-3和p53和Bax的表达变化。结果 药物浓度在100～300 mmol/L的范围显著抑制肝癌细胞增殖，且抑制率随浓度和时间呈依耐性，Caspase-3，Bax和p53的蛋白表达量明显增加。药物浓度在100～300 mmol/L作用48 h，肝癌细胞皱缩，呈现凋亡各期改变，细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.05)。结论 不同浓度的酒精对肝癌细胞BEL-7402有诱导凋亡的作用，其抑制作用呈浓度和时间依赖性。
【关键词】 酒精；肝癌细胞；细胞凋亡
近年来，肝癌的发病率呈逐年上升趋势，特别是在海湾、山谷、或岛屿地区，年死亡率>30/10万[1]，为此，人们努力寻求治疗肝癌的新方法。本课题组利用人肝癌细胞株BEL-7402，以酒精为诱导物， 初步探究不同浓度的酒精对肝癌细胞的增殖和凋亡的影响，为进一步的开发和应用提供一定的实验依据。
1 资料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料 四甲基偶氮唑蓝(MTT)，Hoechst 33258试剂、维甲酸(RA)系Sigma公司产品；Caspase-3、p53、Bax及β-actin抗体购于Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA,USA)公司。HRP标记羊抗鼠IgG(中杉金桥公司)。无水酒精等其余试剂为国产分析纯。
1.1.2 细胞培养 肝癌细胞购自中国医学科学院基础医学研究所。采用含10%灭活胎牛血清(天津灏洋生物制品公司)的RPMI 1640 (Gibco公司)，青霉素(100 U/ml)和链霉素(100 μg/ml)的培养体系培养。培养环境为37℃，含50 ml/LCO2培养箱。取对数生长期的细胞进行实验。
1.2 方法
1.2.1 MTT法检测酒精对肝癌细胞增殖的影响 肝癌细胞以1×104/ml接种到96孔细胞培养板，0.2 ml/孔，继续培养24 h后换液，分别用加入不同浓度的酒精含血清RPMI1640培养液处理细胞(每个浓度5个复孔)，对照组只加培养液。继续分别培养细胞12 h、24 h、48 h、72 h，每孔加入 5 g/L MTT 20 μl培养 4 h 后，吸去培养液，每孔加入150 μl DMSO于振荡器上振摇，待蓝色晶体完全溶解后，在酶标仪上测定 570 nm 处的吸光度值(A值)并计算抑制率。以含有等体积的培养液和DMSO的无细胞孔测得的吸光度值为空白对照。细胞生长抑制率=(1-处理组吸光度/ 对照组吸光度)×100%。
1.2.2 Hoechst 33258/PI 荧光染色检测凋亡细胞形态 细胞以1×104/ml浓度接种于放有盖玻片的培养皿中，每皿加盖玻片4张，培养至对数生长期，设加入不同量的酒精(100 mmol/L、200 mmol/L和300 mmol/L) 和不加药物的空白对照组，作用48 h。爬片用5 mg/L PI染色15 min后PBS冲洗三次，每次5分钟。然后-20℃冷丙酮固定6 min，PBS冲洗后，加5 mg/L Hoechst 33258染色30 min，用蒸馏水洗片后中性树胶封片，BX51荧光显微镜(日本Olympus公司)观察细胞凋亡形态改变。
1.2.3 Western blotting分析Caspase-3、Bax和p53的表达 细胞于对数生长期加入不同浓度酒精，作用48 h后收集细胞， 冷PBS洗涤2次，用总细胞蛋白裂解液200 μl，剧烈振荡充分裂解，冰浴30 min， 4 ℃ 12000 rpm离心15 min。 考马斯亮蓝G-250法测样品蛋白并均衡每组蛋白浓度。每孔上样量30 μl, 浓缩胶5%，分离胶12%，样品在浓缩胶时电压8v/cm，在分离胶时电压12v/cm，约2 h。电泳后将PAGE凝胶中的蛋白转移至NC膜上，取出膜用TBST洗3次每次5分钟。 5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST洗五次，每次5分钟。一抗按抗体说明书推荐的浓度(1∶1000)进行孵育， 4℃孵育过夜。二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体, 1∶5 000)室温孵育1 h。ECL化学发光法显示结果，压片曝光。
1.2.4 统计学方法 数据采用均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS 12.0软件包处理, P<0.05差异有统计学意义。所用统计分析方法有单因素方差分析(多重比较采用Dunnet-t检验)，成组t检验。
2 结果
2.1 酒精对肝癌细胞增殖的抑制作用 不同浓度的酒精对肝癌细胞均有增殖抑制作用, 呈现剂量-时间依赖关系(图1)。100 mmol•L-1酒精即可显著抑制肝癌细胞生长，300 mmol•L-1酒精对肝癌细胞生长抑制作用更显著。
酒精对肝癌细胞增殖的抑制作用(n=5,x±s)
2.2 Hoechst 33258/ PI荧光染色检测细胞凋亡 经Hoechst 33258/ PI荧光染色后，在荧光显微镜下凋亡细胞可见细胞核浓染致密的颗粒荧光，正常细胞核呈弥漫均匀的荧光(图2)。对照组、100 mmol•L-1、200 mmol•L-1和300 mmol•L-1酒精作用于肝癌细胞48 h 后可见细胞凋亡率分别为(5.06 ±2.60) %，(19.40±3.71) %，(32.94±2.95) %，(49.42±8.01) %，每实验组三重复，每张盖片记数9个视野，肝癌细胞的凋亡率随着酒精浓度的增大而升高，呈一定的剂量依赖关系。
2.3 酒精对Caspase-3、Bax和p53蛋白表达的影响 酒精作用细胞48 h，100 mmol•L-1、200 mmol•L-1和300 mmol•L-1处理组，Caspase-3、Bax和p53蛋白表达量均明显高于对照组(图3)。
3 讨论
酒精抑制肿瘤细胞增殖及诱导细胞凋亡的作用已见报道[2~4]。本课题组用MTT 比色法显示不同浓度的酒精有显著的细胞增殖抑制作用，且抑制作用具有酒精浓度和时间依赖性。形态学观察细胞核型的改变是细胞凋亡检测的最直观的方法。Hoechst33258和PI染色结果显示，不同浓度的酒精作用细胞，会引起细胞染色质凝聚，细胞核碎裂、片段化，说明细胞发生了凋亡。
本研究从形态学发现酒精具有诱导肝癌细胞凋亡的作用，尤其高浓度酒精(300 mmol•L-1)能够显著诱导肝癌细胞凋亡。在分子水平上，P53蛋白在正常细胞中具有“分子警察”的作用，当细胞受到应激反应，P53表达增高，对DNA损伤进行修复。当修复不成功，细胞启动线粒体凋亡通路，发生凋亡。Caspase-3即半胱氨天冬氨酰蛋白酶 ......
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