流产模型孕鼠脾脏调节性T细胞分离纯化方法的初步建立(2)
磁珠阳性分选CD4+CD25+T细胞和阴性分选CD4+CD25T细胞：计数从分选柱中流出的CD4+T细胞，调细胞浓度，得量为1×107个细胞。用90 μl buffer 重悬，加入10 μL CD25磁珠，混匀，4~8 ℃孵育15 min，将MS磁珠分选柱置于分选器中，500 μl buffer 过柱，然后将细胞悬液加入其中，用3 500 μl buffer 洗柱，收集流下来的细胞悬液和洗柱液，此收集液即为CD4+CD25T细胞，留作转化实验用。然后将柱子放入收集管中，移开磁场，向柱子中再加入1 ml buffer,用塞子快速将磁珠标记的CD4+CD25+调节性T细胞冲出柱子。
细胞计数：190 μl台盼兰+10 μl细胞悬液，混匀，取10 μl滴于计数板上，计数2个相对大方格内的细胞总数。观察细胞存活率。细胞存活率计算公式如下：细胞存活率=染色阴性细胞数/细胞总数 100%。143 流式细胞仪检测 取1 105个细胞用抗CD4FITC、抗CD25PE的抗体双色标记，室温避光孵育30 min后，用PBS液洗涤重悬，上流式细胞仪检测分选的CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25细胞T的纯度。2 结果
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流产模型孕鼠脾脏细胞经过多次免疫磁珠细胞分选法两步分选得到CD4+/CD25+调节性T细胞纯度为(93511)%，CD4+/CD25T细胞纯度为(96606)%，如图1、图2。图1 分选后的调节性T细胞，CD4+/CD25+图2 分选后的CD4+/CD25细胞3 讨论
CD4+CD25+调节性T细胞(Treg细胞)是一类具有调节功能的T细胞群体，其可能通过抑制CD4+/CD8+T细胞，B细胞增生，抑制抗原提呈细胞(APC),如子宫树突状细胞(uDCs)和单核细胞成熟，抑制子宫NK细胞的细胞毒作用，以及Ig、细胞因子的产生等来维持母体对孕体的免疫耐受[3]，Zenclussen等[4,5]发现自然流产模型小鼠中Treg细胞在数量和功能上比正常妊娠模型小鼠都显示有一定程度的下降，妊娠诱导的Treg细胞在母胎耐受中起到了至关重要的作用，由于该类细胞调节免疫的机理尚未得到完全阐明，因此分离、培养和扩增Treg细胞，已成为目前研究母胎免疫耐受的重要内容之一。
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实验中如何获得大量Treg细胞是进行研究的前提条件。我们采用密度梯度离心法，从孕鼠脾脏组织中分离外周血单个核细胞，包括淋巴细胞、少量的单核细胞、中性粒细胞及混杂的红细胞和血小板。其原理是利用各种细胞大小、密度、表面电荷、黏附能力等的差异进行分离[6]，本实验采用小鼠淋巴细胞分离液作为分离纯化试剂。
对于用于体外扩增的Treg细胞，目前常用的分选方法是免疫磁珠分选和流式细胞分选。免疫磁珠分选一般用CD4、CD25抗原作为分选标记来纯化小鼠的Treg细胞，其原理是将包被有关抗体的磁珠与待分离细胞充分作用，这样借助于抗体磁珠，将与相应的细胞结合成：细胞抗体磁珠复合物，该细胞在磁场中运动与其他细胞产生明显差别。如采用层析的方法，将层析柱放于强磁场中，与磁珠结合的细胞运动将受限，而未与磁珠结合的细胞将先被洗脱下出来，再将该柱移出磁场，与结合的细胞也将被洗脱下来，达到分离目的。
免疫磁珠分选和常用的流式细胞分选相比，具有快速、高效、对靶细胞的活性和功能干扰少的优点，流式细胞分选虽然可以同时对2个甚至更多的CD荧光抗体标记信号一次性进行分选，分离纯度高，但分离速度慢，细胞最终获得率低，对细胞损伤较大，对于功能性的表面分子有激惹作用。综合看来，我们采用免疫磁珠两步分选来得到CD4+CD25+调节性T细胞和CD4+CD25T细胞，对于孕鼠脾脏淋巴细胞的分离纯化，取得较好的分离效果，细胞纯度和活性均较高，为通过流产模型孕鼠(和正常对照)来进行复发性自然流产的相关性研究提供了方法学基础。
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参 考 文 献[1] Tafuri A, Alferink J, Moller P, et al T cell awareness of paternal alloantigena during pregnancy. Science, 1995, 270(5236):630633.[2] 邱丽华,林其德调节性T淋巴细胞与原因不明复发性流产的相关性研究.中华妇产科杂志,2004,39(12):816818.[3] Zhao FX, Zhang YY, Liu RH, et al.Effect of CD86 blockage on the expressions of TGF&1,MMP9,TIMP3 and PAI1 proteins and outcome of pregnancy in murine abortionprone model. J Microbiol Immunol，2006, 4(2):137145.[4] Zenclussen A C， Gerlof K, Zenclussen M C，et al Abnormal T cell reactivity against paternal antigens in spontaneous abortion: Adoptive transfer of pregnancyinduced CD4+CD25+ T regulatory cells prevents fet al rejection in a murine abortion model. Am J Pathol, 2005,166(3):811822.[5] Zenclussen A C CD4+CD25+ T regulatory cells in murine pregnancy. J Repord Immunol, 2005,65(2):101110.[6] 张诚,陈幸华,张曦,等不同明胶浓度及淋巴细胞分离液对人脐血源黏附细胞原代培养的影响中国实验血液学杂志,2008,16(6):14371441., http://www.100md.com(殷治华 赵富玺 穆雅琴 刘润花 王健 冯婷婷 齐彦)
细胞计数：190 μl台盼兰+10 μl细胞悬液，混匀，取10 μl滴于计数板上，计数2个相对大方格内的细胞总数。观察细胞存活率。细胞存活率计算公式如下：细胞存活率=染色阴性细胞数/细胞总数 100%。143 流式细胞仪检测 取1 105个细胞用抗CD4FITC、抗CD25PE的抗体双色标记，室温避光孵育30 min后，用PBS液洗涤重悬，上流式细胞仪检测分选的CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25细胞T的纯度。2 结果
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流产模型孕鼠脾脏细胞经过多次免疫磁珠细胞分选法两步分选得到CD4+/CD25+调节性T细胞纯度为(93511)%，CD4+/CD25T细胞纯度为(96606)%，如图1、图2。图1 分选后的调节性T细胞，CD4+/CD25+图2 分选后的CD4+/CD25细胞3 讨论
CD4+CD25+调节性T细胞(Treg细胞)是一类具有调节功能的T细胞群体，其可能通过抑制CD4+/CD8+T细胞，B细胞增生，抑制抗原提呈细胞(APC),如子宫树突状细胞(uDCs)和单核细胞成熟，抑制子宫NK细胞的细胞毒作用，以及Ig、细胞因子的产生等来维持母体对孕体的免疫耐受[3]，Zenclussen等[4,5]发现自然流产模型小鼠中Treg细胞在数量和功能上比正常妊娠模型小鼠都显示有一定程度的下降，妊娠诱导的Treg细胞在母胎耐受中起到了至关重要的作用，由于该类细胞调节免疫的机理尚未得到完全阐明，因此分离、培养和扩增Treg细胞，已成为目前研究母胎免疫耐受的重要内容之一。
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实验中如何获得大量Treg细胞是进行研究的前提条件。我们采用密度梯度离心法，从孕鼠脾脏组织中分离外周血单个核细胞，包括淋巴细胞、少量的单核细胞、中性粒细胞及混杂的红细胞和血小板。其原理是利用各种细胞大小、密度、表面电荷、黏附能力等的差异进行分离[6]，本实验采用小鼠淋巴细胞分离液作为分离纯化试剂。
对于用于体外扩增的Treg细胞，目前常用的分选方法是免疫磁珠分选和流式细胞分选。免疫磁珠分选一般用CD4、CD25抗原作为分选标记来纯化小鼠的Treg细胞，其原理是将包被有关抗体的磁珠与待分离细胞充分作用，这样借助于抗体磁珠，将与相应的细胞结合成：细胞抗体磁珠复合物，该细胞在磁场中运动与其他细胞产生明显差别。如采用层析的方法，将层析柱放于强磁场中，与磁珠结合的细胞运动将受限，而未与磁珠结合的细胞将先被洗脱下出来，再将该柱移出磁场，与结合的细胞也将被洗脱下来，达到分离目的。
免疫磁珠分选和常用的流式细胞分选相比，具有快速、高效、对靶细胞的活性和功能干扰少的优点，流式细胞分选虽然可以同时对2个甚至更多的CD荧光抗体标记信号一次性进行分选，分离纯度高，但分离速度慢，细胞最终获得率低，对细胞损伤较大，对于功能性的表面分子有激惹作用。综合看来，我们采用免疫磁珠两步分选来得到CD4+CD25+调节性T细胞和CD4+CD25T细胞，对于孕鼠脾脏淋巴细胞的分离纯化，取得较好的分离效果，细胞纯度和活性均较高，为通过流产模型孕鼠(和正常对照)来进行复发性自然流产的相关性研究提供了方法学基础。
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参 考 文 献[1] Tafuri A, Alferink J, Moller P, et al T cell awareness of paternal alloantigena during pregnancy. Science, 1995, 270(5236):630633.[2] 邱丽华,林其德调节性T淋巴细胞与原因不明复发性流产的相关性研究.中华妇产科杂志,2004,39(12):816818.[3] Zhao FX, Zhang YY, Liu RH, et al.Effect of CD86 blockage on the expressions of TGF&1,MMP9,TIMP3 and PAI1 proteins and outcome of pregnancy in murine abortionprone model. J Microbiol Immunol，2006, 4(2):137145.[4] Zenclussen A C， Gerlof K, Zenclussen M C，et al Abnormal T cell reactivity against paternal antigens in spontaneous abortion: Adoptive transfer of pregnancyinduced CD4+CD25+ T regulatory cells prevents fet al rejection in a murine abortion model. Am J Pathol, 2005,166(3):811822.[5] Zenclussen A C CD4+CD25+ T regulatory cells in murine pregnancy. J Repord Immunol, 2005,65(2):101110.[6] 张诚,陈幸华,张曦,等不同明胶浓度及淋巴细胞分离液对人脐血源黏附细胞原代培养的影响中国实验血液学杂志,2008,16(6):14371441., http://www.100md.com(殷治华 赵富玺 穆雅琴 刘润花 王健 冯婷婷 齐彦)