VEGF/VEGFR在缺血再灌注损伤中神经保护作用分析
【摘要】 目的 探讨VEGF/VEGFR在脑缺血再灌注损伤中神经保护作用。方法 108只SD大鼠， 随机分为对照组、假手术组、抗体组(VEGFR)， 各36只。对脑动脉缺血再灌注损伤模型(MCAO)进行制备， 假手术组无缺血现象， 在造模前20 min抗体组侧脑室予以VEGF抗体注射， 对照组、假手术组均予以等量生理盐水注射， 造模后1、3、7 d对三组Bederson评分予以比较。结果 VEGFR抗体组Bederson评分明显高于对照组和假手术组， 差异有统计学意义(P<0.05)。结论 针对脑缺血再灌注损伤， VEGF的活化早刺激下， 使VEGFR表达不断上调， 加速血管内皮细胞增殖， 促进形成新生血管。
【关键词】 血管内皮生长因子；Bederson评分；脑缺血再灌注损伤；脑内皮细胞
DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.33.211
VEGF是指血管内皮生长因子， 对于内皮细胞而言， 是一种强力丝裂剂， 促进新生血管生长作用非常强大， 此内源性血管生成因子， 具有较强的作用和特异性， 缺血性脑损伤出现后， 在再生血管的作用下， 有助于缺血半暗带的血供尽早恢复， 对神经功能的恢复具有较好的促进作用[1]。本次研究选取108只SD大鼠， 随机分为对照组、假手术组和抗体组(VEGFR)， 现报告如下。
1 资料与方法
1. 1 一般资料 本次研究选取108只SD大鼠， 随机分为对照组、假手术组、抗体组(VEGFR)， 各36只。体质量为(250±30)g；试剂：VEGFR2兔抗大鼠IgG多抗、VEGFR兔抗大鼠IgG 、VEGF兔抗大鼠IgG多抗；CY3山羊抗兔二抗、内参Actin蛋白。
1. 2 方法 制备栓线：采用尼龙线(长约3 cm、直径为0.28 mm)， 使用油性笔在2 cm处做标记， 使用硅胶包裹侵泡消毒后的尼龙线， 之后放在肝素盐水中(100 U/ml)备用。
1. 2. 1 制备动物模型 对脑动脉缺血再灌注损伤模型(MCAO)进行制备， 假手术组无缺血现象， 在造模前20 min抗体组侧脑室予以VEGF抗体注射， 对照组、假手术组均予以等量生理盐水注射。模型制备：栓线放入后， 使用消毒钢尺对血管外线长度进行测量， 对栓线进入的实际长度进行计算， 确保颅内栓线插入后， 深度为18～20 mm， 距离穿刺点5 mm外， 将残留栓线剪断， 隐藏于胸锁突肌下， 缺血后60 min将栓线拔出， 采用Bederson评分， >2分确定为梗死， 对照组与抗体组均使用Bederson评分。
1. 2. 2 制备脑组织 采用水合氯醛(10%)对大鼠腹腔进行注射麻醉， 准备小杯并放入液氮， 断头取脑必须迅速， 接着放入小杯中， 脑组织在10～20 s后迅速冰结成块， 接着放入冰箱(-80℃)中备用。
采用Western blot 对缺血半暗带区VEGFR的表达进行检测：采用TBS漂洗组织样品后， 加入 RIPA 缓冲液裂解液， BCA 法测定蛋白质浓度， 加热变性、转膜， 5%脱脂奶粉封闭1～2 h， VEGFR 兔抗大鼠IgG多抗(1/400)杂交过夜， TBST 洗膜后加入 HRP 标记山羊抗兔二抗(1/5 000)孵育1 h， TBST 洗膜后进行 ECL 化学发光法显影。
1. 3 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数 ± 标准差( x-±s)表示， 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
VEGFR抗体组Bederson评分明显高于对照组和假手术组， 差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
3 讨论
修复神经系统缺血再灌注损伤， 最好的方法就是血管再生， 这需要对平滑肌细胞、血管周细胞及内皮细胞的众多作用的调节因子， 进而构成信号网络， 其中对血管系统具有特定作用的重要信号因子包括：一种是VEGF/VEGFR信号传导系统；另一种是促血管生成素， 缺血性脑损伤出现后， 容易形成动脉血管闭塞， 导致局部脑组织出现缺氧、缺血现象， 但在侧支循环中仍有缺血半暗带存在， 且存活有大量神经元。如果血液能够迅速恢复， 此种损伤便具有可逆性， 而侧支循环及新生血管对其具有决定性作用， 脑缺血再灌注损伤时， VEGF与VEGFR的充分结合， 对内皮血管迁移、增生、形成微血管管型结构及生成成熟血管具有较好的促进作用[2]。
VEGF及其受体对新生血管的生成具有较好的特异性， 因此， 缺血再灌注后出现的脑损伤， 较为关注的研究热点就是VEGF/VEGFR对神经细胞的保护作用。当前， 一些可能性的作用机制主要有：在缺氧、缺血情形下， VEGF及其受体蛋白的表达会不断上升， 增加生物活性得以激活后， 对内皮增殖具有促进作用， 进而对内皮凋亡产生较好的阻碍作用；VEGF对骨髓源性内皮前体细胞活化具有较好的诱导作用， 当骨髓进入血液循环后， 将会使血管的增生能力得以增强。同时在血管的生成过程中， 整合素也具有重要作用， 并积极参与内皮增殖作用中。在本次研究中， 脑缺血再灌注大鼠， 术后第1天便可以检测到VEGFR表达， 在之后的3～5 d， 其表达达到高峰， 此时处于缺血半暗带的VEGFR2也会快速表达。可见， 增加供氧量及血液再灌注， 对脑神经保护作用的恢复效果较好。
综上所述， 针对脑缺血再灌注损伤， 早VEGF的活化刺激下， 使VEGFR表达不断上调， 加速血管内皮细胞增殖， 促进形成新生血管。
参考文献
[1]宓丹， 马贤德， 王建.眼针对局灶性脑缺血再灌注大鼠VEGF/VEGFR系统表达的影响.山东大学学报(医学版)， 2013， 51(2)： 22-26.
[2]刘轲， 李建生， 高剑峰， 等.脑脉通对老龄大鼠脑缺血再灌注微血管生成及VEGF/VEGFR系统表达的影响.中华中医药杂志， 2010(12)：2088-2092.
[收稿日期：2015-06-11], 百拇医药(马涛)
【关键词】 血管内皮生长因子；Bederson评分；脑缺血再灌注损伤；脑内皮细胞
DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.33.211
VEGF是指血管内皮生长因子， 对于内皮细胞而言， 是一种强力丝裂剂， 促进新生血管生长作用非常强大， 此内源性血管生成因子， 具有较强的作用和特异性， 缺血性脑损伤出现后， 在再生血管的作用下， 有助于缺血半暗带的血供尽早恢复， 对神经功能的恢复具有较好的促进作用[1]。本次研究选取108只SD大鼠， 随机分为对照组、假手术组和抗体组(VEGFR)， 现报告如下。
1 资料与方法
1. 1 一般资料 本次研究选取108只SD大鼠， 随机分为对照组、假手术组、抗体组(VEGFR)， 各36只。体质量为(250±30)g；试剂：VEGFR2兔抗大鼠IgG多抗、VEGFR兔抗大鼠IgG 、VEGF兔抗大鼠IgG多抗；CY3山羊抗兔二抗、内参Actin蛋白。
1. 2 方法 制备栓线：采用尼龙线(长约3 cm、直径为0.28 mm)， 使用油性笔在2 cm处做标记， 使用硅胶包裹侵泡消毒后的尼龙线， 之后放在肝素盐水中(100 U/ml)备用。
1. 2. 1 制备动物模型 对脑动脉缺血再灌注损伤模型(MCAO)进行制备， 假手术组无缺血现象， 在造模前20 min抗体组侧脑室予以VEGF抗体注射， 对照组、假手术组均予以等量生理盐水注射。模型制备：栓线放入后， 使用消毒钢尺对血管外线长度进行测量， 对栓线进入的实际长度进行计算， 确保颅内栓线插入后， 深度为18～20 mm， 距离穿刺点5 mm外， 将残留栓线剪断， 隐藏于胸锁突肌下， 缺血后60 min将栓线拔出， 采用Bederson评分， >2分确定为梗死， 对照组与抗体组均使用Bederson评分。
1. 2. 2 制备脑组织 采用水合氯醛(10%)对大鼠腹腔进行注射麻醉， 准备小杯并放入液氮， 断头取脑必须迅速， 接着放入小杯中， 脑组织在10～20 s后迅速冰结成块， 接着放入冰箱(-80℃)中备用。
采用Western blot 对缺血半暗带区VEGFR的表达进行检测：采用TBS漂洗组织样品后， 加入 RIPA 缓冲液裂解液， BCA 法测定蛋白质浓度， 加热变性、转膜， 5%脱脂奶粉封闭1～2 h， VEGFR 兔抗大鼠IgG多抗(1/400)杂交过夜， TBST 洗膜后加入 HRP 标记山羊抗兔二抗(1/5 000)孵育1 h， TBST 洗膜后进行 ECL 化学发光法显影。
1. 3 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数 ± 标准差( x-±s)表示， 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
VEGFR抗体组Bederson评分明显高于对照组和假手术组， 差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
3 讨论
修复神经系统缺血再灌注损伤， 最好的方法就是血管再生， 这需要对平滑肌细胞、血管周细胞及内皮细胞的众多作用的调节因子， 进而构成信号网络， 其中对血管系统具有特定作用的重要信号因子包括：一种是VEGF/VEGFR信号传导系统；另一种是促血管生成素， 缺血性脑损伤出现后， 容易形成动脉血管闭塞， 导致局部脑组织出现缺氧、缺血现象， 但在侧支循环中仍有缺血半暗带存在， 且存活有大量神经元。如果血液能够迅速恢复， 此种损伤便具有可逆性， 而侧支循环及新生血管对其具有决定性作用， 脑缺血再灌注损伤时， VEGF与VEGFR的充分结合， 对内皮血管迁移、增生、形成微血管管型结构及生成成熟血管具有较好的促进作用[2]。
VEGF及其受体对新生血管的生成具有较好的特异性， 因此， 缺血再灌注后出现的脑损伤， 较为关注的研究热点就是VEGF/VEGFR对神经细胞的保护作用。当前， 一些可能性的作用机制主要有：在缺氧、缺血情形下， VEGF及其受体蛋白的表达会不断上升， 增加生物活性得以激活后， 对内皮增殖具有促进作用， 进而对内皮凋亡产生较好的阻碍作用；VEGF对骨髓源性内皮前体细胞活化具有较好的诱导作用， 当骨髓进入血液循环后， 将会使血管的增生能力得以增强。同时在血管的生成过程中， 整合素也具有重要作用， 并积极参与内皮增殖作用中。在本次研究中， 脑缺血再灌注大鼠， 术后第1天便可以检测到VEGFR表达， 在之后的3～5 d， 其表达达到高峰， 此时处于缺血半暗带的VEGFR2也会快速表达。可见， 增加供氧量及血液再灌注， 对脑神经保护作用的恢复效果较好。
综上所述， 针对脑缺血再灌注损伤， 早VEGF的活化刺激下， 使VEGFR表达不断上调， 加速血管内皮细胞增殖， 促进形成新生血管。
参考文献
[1]宓丹， 马贤德， 王建.眼针对局灶性脑缺血再灌注大鼠VEGF/VEGFR系统表达的影响.山东大学学报(医学版)， 2013， 51(2)： 22-26.
[2]刘轲， 李建生， 高剑峰， 等.脑脉通对老龄大鼠脑缺血再灌注微血管生成及VEGF/VEGFR系统表达的影响.中华中医药杂志， 2010(12)：2088-2092.
[收稿日期：2015-06-11], 百拇医药(马涛)