腭突间充质细胞中TGFβ1信号通路介导维甲酸致腭裂的实验研究(2)
1 材料与方法1. 1 实验动物 8~10周龄的野生型C57BL/6J小鼠购自于广东省医学实验动物中心[许可证号SCXK(粤)2013-0002]。SPF级环境下饲养, 12 h光照, 12 h黑暗, 食物和水自由获取。交配当天晚上以雌雄2∶1的比例合笼, 次日早晨检测雌鼠阴道栓, 阳性者记为E0.5。
1. 2 RA诱导腭裂模型的构建 分别取E13.5(E13.5组)、E15.5
(E15.5组)和E17.5(E17.5组)的腭突, q-PCR检测TGFβ1基因的表达, Western blot检测下游p-Smad2(S467)的表达;RA购于上海sigma公司, 模型的构建参照先前的报道进行[2]。
1. 3 q-PCR检测 分别取各组的胚鼠, 于解剖镜下剪取腭突组织, 加入Trigene试剂提取总RNA, 用RE-TROscript逆转录试剂盒合成cDNA, 用q-PCR(SYBR green)检测的方法, 以β-actin为内参, 分析TGFβ1的基因表达水平。以上试剂均购自北京康润生物公司。
1. 4 Western blot检测 分别取各组的腭突组织, 于液氮中研磨成粉末 ......
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