孙琦 俞一峰

    1 资料与方法

    1.1 一般资料 选取2010年8月～2012年6月在江阴市人民医院行手术治疔的结直肠癌患者, 年龄25～85岁, 平均年龄(61.5±10.1)岁。随访采用门诊复查、电话、书信、电子邮件等方式进行。无病生存期定义根治性治疗后到肿瘤复发或因各种原因出现死亡的时间, 以月为单位计算。至研究终点(2017年5月)。其中具有完整随访资料者138例, 随访时间(43.9±21.6)个月。

    1.2 MSI检测

    1.2.1 核酸提取 血液标本：采用新景血液提取试剂盒；DNA无需稀释, 直接用于聚合酶链反应(PCR)。石蜡标本：采用QIAGEN石蜡提取试剂盒；DNA稀释至20 ng/μl用于PCR的模板。核酸定量：使用Qubit进行核酸定量。

    1.2.2 试剂 引物为NR-21、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26, 产物长度分别为110 bp、132 bp、154 bp、123 bp、122 bp, 修饰方法分别为5'-FAM、5'-FAM、5'-HEX、5'-TMR、5'-HEX。

    1.2.3 操作步骤 反应体系的配制：以一个位点的体系配制为例。从-20℃冰箱中取出试剂以及待检样品DNA, 待其融化后, 短暂离心, 将管壁和管盖上的液体收集到管底。在试剂准备区配制20 μl PCR反应体系, 各组分及添加量如下。

    1.2.4 PCR扩增 在扩增区按如下的反应条件进行PCR扩增 ：94℃ 4 min, 94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s 10 个循环 ,94℃ 30 s、53℃ 30 s、72℃ 30 s 30 个循环 , 72℃ 30s, 10℃ ∞ ......