生长激素对大鼠胫骨生长板软骨细胞胶原Ⅱ表达的影响(2)
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1.7 统计学方法 实验数据用均数±标准差表示。采用SPSS13.0统计软件进行分析,组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 原代培养大鼠胫骨生长板软骨细胞的形态学观察 原代培养的软骨细胞接种后呈小圆球形,折光性强,悬浮于培养液中,细胞的大小基本一致。培养24~36 h后原代细胞贴壁完成,呈扁平状,多角形,胞浆丰富,胞核清晰,可见1~2个核仁。培养7~8 d后,原代细胞90%融合,细胞形态不规则,呈多边形、星形等,紧密排列成“铺路石”状外观。见图1。
A.原代培养3 d的软骨细胞Primary chondrocyte cultivated for 3 days(×200)
B.原代培养7 d的软骨细胞Primary chondrocyte cultivated for 7 days(×200)
图1 大鼠胫骨生长板软骨细胞的形态学变化
2.2 Ⅱ型胶原(ColⅡ)mRNA表达 GH能促进ColⅡmRNA的表达并呈浓度依赖性,GH在10~500 ng/ml之间能促进ColⅡmRNA的表达,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),并且以100 ng/ml时表达最强,随着GH浓度的加大,其促ColⅡmRNA表达的效应逐渐减弱,1000 ng/ml与对照组比较无差异(P>0.05)。见图2。
图2 生长激素对ColⅡmRNA表达的影响
A.对照组;B.10 ng/ml;C.20 ng/ml;D.50 ng/ml;E.100 ng/ml;F.200 ng/ml;G.500 ng/ml;H.1000 ng/ml
图3 不同浓度的GH对软骨细胞ColⅡ表达的影响
2.3 Ⅱ型胶原(ColⅡ)免疫组化染色结果 GH能促进ColⅡ的表达并呈浓度依赖性,GH在10~500 ng/ml之间能促进ColⅡ的表达,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),并且以100 ng/ml时表达最强,随着GH浓度的加大,其促ColⅡ表达的效应逐渐减弱,1000 ng/ml与对照组比较无差异(P>0.05)。见图3。
3 讨论
近年研究发现,大鼠的基因序列相对于鸡、猪和兔等动物而言与人类有更大的同源性[1],青春期发育过程与人类近似,且生命周期短(2~3年),性成熟期短(2~3个月),因此较为适合作为研究生长发育的动物模型。身高主要由脊柱和下肢的长度组成。身高的基础是骨骼生长,骨骼发育状况最终决定着身高。骨骼生长是以生长板为中心环节的骨合成与骨吸收的动态过程,因此胫骨的生长板最能反映身高的状况。三周龄的大鼠正处于青春发育的早期,此年龄段的大鼠最适合用于模拟人的青春早期生长。此外,软骨细胞分离的数量是与供体的年龄成反比[2],软骨取材标本的供体年龄越轻,组织越新鲜,越易培养成功。因此,采用三周龄大鼠胫骨生长板分离的软骨细胞适合于儿童生长发育障碍疾病的研究。
生长激素是垂体前叶嗜酸细胞分泌的一种多肽激素,能刺激骨、软骨细胞的生长和分化。Ⅱ型胶原是软骨细胞分化的早期标志物,是软骨基质中最主要的胶原类型和发挥软骨正常生理功能的基础[3],主要见于增殖期的软骨细胞。本实验的结果显示,GH在生理浓度10 ng/ml[4]时即能促进ColⅡ的表达,并呈浓度依赖性,以100 ng/ml时表达最强,随着GH浓度的加大,其促ColⅡ表达的效应逐渐减弱,1000 ng/ml与对照组比较无差异。Lindahl等报道GH对软骨细胞的促增殖的最低有效剂量为10 ng/ml,40 ng/ml时促增殖效应最大[5],这说明GH在促进软骨细胞增殖的同时可促进ColⅡ的表达,而其促增殖的浓度与笔者观察到的促ColⅡ表达的浓度略有不同,可能与所用的培养体系与所用动物的年龄不同有关。Ⅱ型胶原对维持软骨细胞的表型,防止其去分化起着重要的作用。已有研究报道证实,GH能抑制体外培养的生长板软骨细胞的分化[6],这与在临床应用GH治疗生长发育障碍的患儿并未发现其会导致骨龄的增加及生长板老化相一致。
参考文献
[1] Thomas W,Touchman JW,Blakesley RW,et al.Comparative analyses of multispecies sequences from targeted genomic regions ......
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