免疫组织化学染色双重修复法在淋巴瘤诊断中的应用体会
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【关键词】免疫组化;双重修复法;恶性淋巴瘤分型
在恶性淋巴瘤的诊断与分型中,免疫组织化学染色标记作为辅助诊断的手段越来越重要,甚至已经成为不可缺少的方法之一。目前,在临床病理诊断中使用免疫组化方法主要是在石蜡包埋组织中进行。在组织固定、包埋等处理过程中很多抗原被封闭。部分抗原需要按照抗体使用指南中的方法来做抗原暴露修复,组织中的部分抗原仍然不能完全暴露,由此造成假阴性,从而影响正确诊断。笔者在临床应用免疫组化技术过程中,体会到将部分组织切片采用抗原双次修复的办法[1],让仅一次抗原修复,封闭抗原未能充分暴露的组织能够得到有效的表达。降低了假阴性和假弱阳性,提高了淋巴瘤诊断与分型的准确率。
1 资料与方法
1.1 一般资料 挑选中山大学附属第五医院病理科 2007~2009年淋巴瘤病例37例,其中最终诊断为弥漫大B细胞淋巴瘤的共有23例,套细胞淋巴瘤的共有9例,结外NK/T细胞淋巴瘤,鼻型的共有5例,性别:男20例,女17例,年龄35~72岁。将石蜡组织标本切片后分2组 A组:热修复组;B组:热修复联合胰酶修复组。
UItraSenSitire Tm S P免疫组化试剂盒(A:内源性过氧化酶阻断剂;B:动物非疫血清;C:生物素标记的二抗;D:链霉菌抗生物素蛋白 过氧化酶)。Trypsin 胰蛋白酶修复液 、PBS冲洗液pH7.4。0.01%柠檬酸中性缓冲修复液、日本产家用微波沪、DAB显色剂。鼠抗人单抗CD3、鼠抗人单抗CD45RO、鼠抗人单抗CD20、鼠抗人单抗CD79a、鼠抗人单抗CyclinD1、鼠抗人单抗CD5、鼠抗人单抗CD56。(以上试剂均购自福建迈新试剂公司)
1.2 方法 ①组织常规固定脱水石蜡包埋切片脱蜡至蒸馏水冲洗 PBS冲洗3 min×3次;
②滴加内源性过氧化酶阻断剂15 minPBS冲洗3 min×3次;
③A组:切片放入柠檬酸修复液盒中置微波沪里修复。100℃微波1~2 min、40℃微波3 min修复,取出修复盒、室温下自然冷却。PBS冲洗3 min×3次;
B组:切片在A组修复的基础上进行第二次修复:滴加0.1%胰酶修复液15 min,PBS冲洗3 min×3次;
④甩去PBS冲洗液,切片同时分别滴加血清15 min;
⑤甩去血清,滴加相应抗体,湿盒置37℃温箱中,孵育2~3 h,取出室温下PBS冲洗3 min×3次;
⑥滴加生物素标记二抗,15 min,PBS 3 min×3次;
⑦滴加链霉菌抗生物素蛋白 过氧化酶15 min,PBS冲洗3 min×3次;
⑧滴加DAB显色剂,显色(约5 min)后将切片用水冲洗、苏木素复染、脱水、透明、封片。
2 结果
光镜下观察两组中每一例淋巴瘤的肿瘤细胞胞浆及胞膜,以大于10%的肿瘤细胞胞浆或胞膜出现清晰的棕黄色颗粒为阳性标准,结果如下:
①23例弥漫性大B细胞淋巴瘤组中,CD20用A方法修复的阳性率为34.78%,B方法修复的阳性率为100%;CD79a用A方法修复的阳性率为30.43%,B方法修复的阳性率为91.30%;CD3及CD45RO为T细胞标记,肿瘤细胞不表达。
表1
CD20及CD79a在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的
阳性表达率
分组A方法B方法
CD20※8/23(34.78%)23/23(100%)
CD79a※※7/23(30.43%)21/23(91.30%)
注:※P值<0.0001,※※P值<0.0001
②9例套区淋巴瘤组中,CD5用A方法修复的阳性率为33.33%,B方法修复的阳性率为88.89%;CyclinD1用A方法修复的阳性率为22.22%,B方法修复的阳性率为88.89%;CD3及CD45RO为T细胞标记,肿瘤细胞不表达。
表2
CD5及CyclinD1在套区淋巴瘤中的阳性表达率
分组A方法B方法
CD5*3/9(33.33%)8/9(88.89%)
CyclinD1**2/9(22.22%)8/9(88.89%)
注:*p值<0.0498,**P值<0.0152
以上结果经统计学分析均有统计学意义,说明在B细胞淋巴瘤中弥漫性大B细胞淋巴瘤及套区淋巴瘤的诊断免疫组织化学染色中,使用双次抗原修复法修复CD20、CD79a及CD5、CyclinD1的阳性率显著高于一次抗原修复法,同时做T细胞标记,两种修复方法均不易产生假阳性。
笔者还对本科室的5例结外NK、T细胞淋巴瘤,鼻型病例进行同样比对,发现CD56用A方法修复的阳性率为60%,B方法修复的阳性率为100%;由于CD45RO在NK/T细胞淋巴瘤中的表达不稳定,所以用方法修复对比没有差异性;CD20及CD79a为B细胞标记,肿瘤细胞不表达。由于样本数小,不适宜做统计学分析,陈列在此仅供参考!
3 讨论
恶性淋巴瘤的病理诊断与鉴别诊断是临床病理诊断中最困难的领域,随着免疫学的发展,免疫组织化学技术不仅在诊断方面提供了有力的依据,而且在具体分型及指导用药方面也起着重要作用。但由于淋巴结本身的结构特点及在石蜡标本制作过程中,组织中的一些抗原容易被封闭,导致免疫标记表达不理想或阴性表达,从而混淆诊断医师的思路,延长诊断时间,甚至误诊!笔者在学习了免疫组化染色中抗原双重暴露法后[1],应用于恶性淋巴瘤的诊断 ......
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