穿心莲内酯抑制缺氧性肺动脉高压的实验研究(2)
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1.2.3 组织标本的制备 将肺组织从小鼠尸体上剪下以后,首先以4%多聚甲醛溶液小鼠的肺组织,然后将肺组织固定于4%多聚甲醛溶液中,固定72 h后进行石蜡包埋。切片时延沿左肺门横断取材,切片厚度为5 μm,供HE染色及免疫组化染色所用。
1.2.4 免疫组化 免疫组化实验中的步骤染色如前所述[6,7]。切片梯次水化入双蒸水,之后用柠檬酸溶液修复抗原5 min。于37℃历30 min用3%过氧化氢甲醇溶液中封闭内源性过氧化物酶。10%BSA封闭1 h后加一抗,抗体rabbit anti-mouseTF Ab 的浓度为1 μg/ml ,阴性对照为Rabbit IgG,浓度亦为1 μg/ml 。Rabbit anti-von Willebrand factor (vWF) polyclonalAb以1:500稀释,阴性对照为Rabbit IgG。加一抗后4℃过夜。二抗(anti Rabbit IgG, HRP)工作浓度为1:100。DAB显色,最后用苏木精复染。
1.2.5 免疫荧光共定位 脱水程序同常规免疫组化,入双蒸水中,不修复抗原。然后将组织切片放入甲醇+0.3%的H2O2溶液中,37℃,30 min;TBS洗3次,每次10 min;将玻片上的溶液擦干,加上10%的BSA,放置于封闭盒中,盒中放入适量双蒸水,37℃,30 min;将10%的BSA直接吸掉,加上一抗,4℃,过夜;TBS洗六次,每次5 min;擦干,加上荧光标记的二抗,37℃,1 h;TBS洗六次,每次5 min,擦干,滴上封片剂,盖上盖玻片,避光保存,自然风干。然后用激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)进行扫描拍照,了解有无共定位。Tissue factor和а-actin 的免疫共定位的一抗的浓度分别为1 μg/ml 和10 μg/ml。阴性对照为:兔IgG+ Mouse IgG2а isotype control,二抗为:anti-mouse IgG-FITC(1:1000)+ Anti-rabbitIgG-CY3(1∶100)。用DAPI染色细胞核。
1.2.6 图像分析
用SPOT COOL CCD 进行图像采集, IMAGE2PROplus 4.1软件进行图像分析,每只小鼠选1 张HE或免疫组化染色切片, 每张切片随机选取200x视野10个,统计直径40～60 μm 肺小动脉的vWF和actin染色阳性的血管数目,然后计算actin/vWF比值(%)作为actin表达的阳性率。
1.2.7 数据分析 所有数据均用均数±标准差(x±s)表示。形态学和免疫组化的阳性率分析用NIH image (version 1.6)软件包进行。统计分析用SPSS软件包中one-way ONOVA或(和)student t test进行,P<0.05认为具有统计学差异。
2 结果
2.1 穿心莲内酯治疗或p50敲除可以显著降低右心室肥厚指数和肺动脉压力 经过5周的低氧培养以后,与正常小鼠相比,C57模型组的右心室明显肥厚,主要表现在心电图的P波增高、右心室肥厚指数上升、肺动脉压力增高(见figure1A、B)。但是经过穿心莲内酯干预后,右心室肥厚指数、肺动脉压力升高受到显著抑制(P<0.01)。然而作为穿心莲内酯的非活化形式,氢化穿心莲内酯组的小鼠则没有明显的下降,这说明,在药物干预的过程中,其作用的是穿心莲内酯,而不是溶剂DMSO,氢化穿心莲内酯也无明显的作用。上述现象在B6模型组小鼠和p50敲除组表现的更加明显figure 1C、D),与B6模型组小鼠相比,p50敲除组小鼠的右心室肥厚指数和肺动脉压力的上升受到更加显著的抑制(P<0.01)。将肺组织的切片进行HE染色,肺小动脉的增厚情况也和上述指标相吻合(figure 1E)。
2.2 穿心莲内酯治疗或p50敲除可以显著降低肺小动脉平滑肌的增生 肺动脉压力升高的主要因素是肺小动脉的平滑肌增生,为了明确平滑肌在各组间的差异,笔者进行了肺组织的vWF和actin的免疫组化染色,前者是血管内膜的标记物,而后者可以明确标定血管平滑肌,结果表明穿心莲内酯治疗或p50敲除可以显著降低肺小动脉平滑肌的增生(figure 2),这主要表现在心莲内酯治疗或p50敲除后,actin/vWF的指数显著下降(P<0.05)。
2.3 NF-κB信号通路在缺氧性肺动脉高压模型中被活化 近来的研究表明, 低氧可激活核因子-κB(NF-κB)[1],提示NF-κB 在低氧性肺动脉高压的发病中可能发挥重要作用。为了验证上述观点,笔者进行了免疫荧光染色,实验结果表明在低氧环境下,p65及p50蛋白均有进核现象发生(figure 3),从而再一次证明了NF-κB信号通路可在低氧环境中被活化,因而靶向核因子-κB的抑制剂(如穿心莲内酯)可能会起到抑制肺动脉高压的作用。
2.4 在低氧性肺动脉高压模型中,组织因子和平滑肌存在共定位 NF-κB信号通路可被多种刺激激活,而且该信号通路被激活以后又可产生多种生物学效应。文献报道,其对组织因子具有调控作用,而组织因子对平滑肌增生的作用已被实验证明,笔者根据上述实验结果推测,在低氧性肺动脉高压模型中,组织因子和平滑肌存在共定位。实验结果表明,在非低氧情况下,组织因子在支气管上皮中有表达,而在平滑肌中无明显表达,但在低氧状况下,组织因子在平滑肌中的表达显著上调(figure 4)。组织因子在肺小动脉平滑肌中的表达上调之后和平滑肌的增生是否有必然的联系、又是怎样促进平滑肌增生的尚无确切的机制,这也是本研究下一步延伸的方向。
图1 穿心莲内酯治疗或p50基因敲除后肺动脉高压的进程明显受到抑制。(A)和 (B):经过5周的低氧后,C57模型组小鼠的肺动脉压力及右心室肥厚指数明显升高,而穿心莲内酯治疗后,上述指标明显受到抑制。(C)和(D):经过5周的低氧后,B6模型组小鼠的肺动脉压力及右心室肥厚指数明显升高,而p50基因敲除后后,上述指标受到更加明显的抑制。 (E):图示各组小鼠经过5周的低氧培养后,肺小动脉的增生差异。*P< 0.05 ;**P< 0.01。图中比例尺为30 μm
图2 (A)、(B):穿心莲内酯治疗或p50基因敲除后肺动脉平滑肌的增生明显受到抑制;(C):图示各组小鼠经过5周的低氧培养后,肺小动脉平滑肌的a-actin免疫染色差异。*P< 0.05 ;**P< 0.01。图中比例尺为30 μm
图3 免疫荧光实验证明,低氧环境下,p65和p50蛋白均有进核,从而说明NF-κB信号通路在低氧环境下得以活化。图中比例尺,左侧三图为50 μm,右侧三图为10 μm ......
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