刘大凯 王罡 赵钢 迟晓飞

    脊髓损伤是周围神经损伤, 是临床常见病之一, 严重影响了人类健康及生活质量, 不同程度的的损伤主要由于外伤所致[1], 目前临床治疗缺乏特效药物, 加快周围神经再生的速度一直是基础和神经研究工作者的研究目标[2]。血府逐瘀, 汤为活血化瘀中药, 由桃仁、红花、当归、川芎、生地、白芍、丹参、牛膝等构成, 宜疏通督脉, 活血化瘀。有研究显示, 血府逐瘀汤能够使兔实验性颈髓急性损伤神经元周围水肿减轻, 白质肿胀减轻, 有明显微血管再通, 细胞凋亡减少作用[3]。本实验旨在通过研究血府逐瘀汤含药血清对背根神经元的保护作用来探讨血府逐瘀汤的作用机理, 为中医药治疗脊髓损伤提供可靠地理论基础。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物 新生24 h的SD大鼠(由实验动物中心提供)10只, 雌雄不限, 体质量为5～8 g。

    1.2 主要实验试剂及设备 血府逐瘀血清(医院自行配置)、蛋白酶(GIBCO公司)、高糖型DMEM/F12培养基、NGF(Invitrogen公司)、鼠尾胶(杭州生友生物技术有限公司)、胎牛血清(PAA公司)、逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]。

    1.3 方法

    1.3.1 背根神经元分离及培养 在无菌的状态下, 用乙醚将10只大鼠麻醉后, 切开背部皮肤, 打开锥板, 解剖显微镜下取出背根神经, 放于4℃清洗液后, 剪成1 mm3的碎块, 移入0.25%的胰蛋白酶的离心管中, 37℃培养箱中进行消化,消化15 min后向试管中加入FBS终止消化并吹打成细胞悬液, 离心10 min, 离心速度为1000 r/min后弃上清, 加入培养基, 将细胞悬液移入未包被的25 cm2的培养瓶中, 37℃条件下继续培养1 h。取未贴壁细胞悬液于另一离心试管中,调节细胞浓度为2.5×105个/ml, 分别在包被好鼠尾胶原的96孔的细胞板中。24 h后全量换液, 48 h后加入阿糖胞苷,终浓度为2.5 μg/ml, 继续培养背根神经元。

    1.3.2 建立细胞损伤模型 将培养5 d的神经元取出, 吸去培养液, 换上亚硫酸钠(浓度为0.3 mol/L)的培养基, 放置在37℃, 5%的CO2的培养箱中继续培养4 h, 复氧2 h后开始按2、6、12、24、48 h时间点收集细胞上清进行相关的实验 ......