邱素华

    消化道的运动依赖消化道平滑肌的收缩, Ca2+是触发平滑肌肌丝滑行的关键因素, 细胞内Ca2+在兴奋收缩耦联中起重要作用, Ca2+浓度改变会导致一系列病理生理过程[1-5]。膜片钳技术可观察结肠平滑肌细胞膜Ca2+电流特征, 为研究及治疗相关疾病提供新的思路[6-10]。膜片钳技术需要高产量和高质量的细胞, 传统的机械分离法对平滑肌细胞的损伤较大, 细胞存活率低, 存活时间短, 难以满足电生理实验需求,因此建立分离结肠平滑肌细胞的方法成为必然。本研究通过查阅国内外现行的平滑肌细胞的分离方法并加以改进[11-15],建立了适合电生理研究的结肠平滑肌细胞分离方法, 该方法操作简便, 重现性好。

    1 材料与方法

    1.1 试剂及溶液 试剂: 胶原酶Ⅱ、大豆胰蛋白酶抑制剂、HEPES及EGTA购于Sigma 公司, 其他试剂均为市售产品。无钙台氏液(mmol/L): 氯化钠(NaCl)137, 氯化钾(KCl)5.4, 六水合氯化镁(MgCl2·6H2O)1, 磷酸二氢钠(NaH2PO4)0.33, 葡萄糖10, 羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)10, 氢氧化钠(NaOH) 调pH至7.40。消化液：含0.1%胶元酶Ⅱ和0.01%大豆胰蛋白酶抑制剂的无钙台氏液。KB液(mmol/L) : KCl 40, KH2PO420, MgCl2·6H2O 3, L-谷氨酸 50, 牛磺酸 20, HEPES 10, 氢氧化钾(KOH) 80, 葡萄糖10, 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)0.5, KOH调pH至7.40。Ca2+电极内液(mmol/L):氯化铯(CsCl)120, 二水氯化钙 (CaCl2·2H2O)1, MgCl2·6H2O 5, 5 5-三磷酸腺苷二钠(ATP-Na2), EGTA 11, HEPES 10, 葡萄糖11,KOH调pH至7.20。Ca2+细胞外液(mmol/L): NaCl 120, CsCl 5, CaCl2·2H2O 1, MgCl2·6H2O 1, 氯化四乙胺 (TEA-Cl)20,Glucose 5.5, HEPES 10, NaOH调pH至7.35。溶液使用前均需氧饱和。

    1.2 方法

    1.2.1 单个结肠平滑肌细胞的分离 参照Bitar法加以改进, Wistar大鼠, 180～220 g, 雌雄不限, 实验前禁食24 h, 自由饮水。颈椎脱臼处死, 剖开腹腔, 快速自肛门上2 cm取结肠约10 cm, 并放置在4℃无钙台氏液中, 冲洗结肠内残余粪便 ......