王彦 马芬芬 梁伟 王琨 刘霞 杨伏猛 王西珍

    医疗水平的提升在很大的上延长了部分严重疾病患者的生存年限,但也增加了真菌感染性疾病发生的几率。既往有资料记载[1],侵袭性真菌感染者的死亡率高达50%,虽然部分抗真菌药物对真菌感染的进程能起到一定控制作用,但伴随真菌对其产生耐药性及标准化抗真菌治疗未取得显著疗效,临床治疗难度相应增加,越来越多的人投身到真菌的耐药机制研究中。本文主要研究热带假丝酵母菌、白色假丝酵母菌可能的耐药机制。

    1 材料与方法

    1.1 材料来源 选取2019 年1 月～2020 年6 月入住本院治疗的100 例真菌培养阳性者,ATCC 90029 白色假丝酵母菌、ATCC 750 热带假丝酵母菌、ATCC 6258克柔假丝酵母菌作为标准质控菌株。

    1.2 方法

    1.2.1 仪器和试剂 DNA提取试剂盒,PCR试剂盒,PCR 引物及扩增仪、离心机及成像系统等。

    1.2.2 菌株鉴定和体外药敏试验 对菌株采用分离、纯化处理,初步筛选菌株。针对采集的菌株纯化以后进行接种,恒温孵育48 h,提取呈白、绿、蓝、紫及红色的酵母样菌落作试样；获取DNA 后扩增、测序初筛后的菌株,完整标准化的分子生物学鉴定。利用专业软件校正测序峰图与基因序列(ITS1 区、D 区)。检测采集到的100 株假丝酵母菌菌株的MIC,并进行体外药物敏感性试验,每次均选标准株作为质控菌株,其MIC值处于M27～S4 设定的区间中,就判读对应的试验操作有效。本次试验获得耐氟康唑的热带假丝酵母菌5 株、白色假丝酵母菌9 株。

    1.2.3 提取假丝酵母菌DNA 严格依照基因抽提试剂盒说明书进行操作,提取以上分离株的基因组DNA。

    1.2.4 基因扩增 分别把基因文库登录号AY856352与M23673 作为已知序列设定2 对引物,分别设置白色假丝酵母菌ERG3 引物序列和热带假丝酵母菌引物序列 ......