定点突变重组ING4腺病毒基因转染系统的载体构建及鉴定
ING基因,基因治疗,氨基酸序列,人源化,质粒,酶切,大肠杆菌
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耿俊颖 刘德生 王红兵 徐海洋 徐州医学院附属医院肿瘤科;
【摘要】目的重组构建hING4(人ING4)氨基酸序列。方法运用定点突变技术,在鼠ING4的基础上,设计两对突变引物P1、P2和P3、P4及全长ING4上下游引物P5、P6,通过四轮PCR,将mING4基因序列进行人源化改造,获得了编码hING4氨基酸的基因序列。将获得酶切目的基因片段,连接到转移载体pAdTrack-CMV上,形成重组转移载体pAdTrack-CMV-ING4。重组转移载体经PmeI酶切后与pAdEasy-1腺病毒载体在BJ5183大肠杆菌中同源重组,得到重组腺病毒载体pAdeasy-1-pAdTrack-CMV-ING4,经PacI酶切后脂质体转染QBI-293A包装细胞,获得重组腺病毒Ad-ING4。结果测序和RT-PCR结果表明hING4基因构建成功。结论hING4基因重组腺病毒载体构建成功。
【关键词】 ING基因 点突变 腺病毒 载体构建 基因治疗 氨基酸序列 人源化 质粒 酶切 大肠杆菌
【分类号】R346
人ING4(hING4)和鼠ING4在66位与156位不同,氨基酸在小鼠为R、A,而在人为K、T。通过对克隆的mING4定点突变技术,将鼠ING4基因序列进行人源化改造,获得编码人ING4氨基酸的基因序列,在此基础上构建了Ad-ING4重组腺病毒表达载体,为肺癌的基因治疗研究奠定基础[1]。1材料与方法1.1
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[摘要] 目的 重组构建hING4(人ING4)氨基酸序列。方法 运用定点突变技术,在鼠ING4的基础上,设计两对突变引物P1、P2和P3、P4及全长ING4上下游引物P5、P6,通过四轮PCR,将mING4基因序列进行人源化改造,获得了编码hING4氨基酸的基因序列。将获得酶切目的基因片段,连接到转移载体pAdTrack-CMV上,形成重组转移载体pAdTrack -CMV-ING4。重组转移载体经PmeI酶切后与pAdEasy-1腺病毒载体在BJ5183大肠杆菌中同源重组,得到重组腺病毒载体pAdeasy-1-pAdTrack-CMV-ING4,经PacI酶切后脂质体转染QBI-293A包装细胞,获得重组腺病毒Ad-ING4。结果 测序和RT-PCR结果表明hING4基因构建成功。结论 hING4基因重组腺病毒载体构建成功。
[关键词] ING4基因;点突变;腺病毒;载体;基因治疗
[中图分类号] R34[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701(2009)32-18-03
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