UCA1在膀胱癌中的表达及临床意义(2)
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1.3.3实时PCR运用NCBI Primer Design Tool 设计引物,UCA1 Forward primer GCTTAGGCTGGCAACCATCA,Reverse primer AAGCTGAGGCTGGCAAAGAG;GAPDH Forward primer GAAGGTGAAGGTCGGAGTC,Reverse primer GAAGATGGTGGG ATTTC,分别扩增190bp和226bp片段长度,引物送Ivitrogen公司合成。运用SYBR GREEN II real time PCR 法,反应条件:10μL反应体系中含有SYBR○RPremix Ex TaqTM Ⅱ 5μL,PCR Forward Primer和 PCR Reverse Primer 各0.4μL,dH2O 3.2μL,DNA 模板1μL,扩增条件95℃ 5sec,60℃ 15sec, 72℃ 15sec,共45个循环。熔解曲线条件95℃ 5sec、4.4℃/s, 65℃ 1min、2.2℃/s。
1.4结果判定
Roche Light Cycler480荧光定量PCR仪检测结果由Light Cycler软件系统进行分析,相对定量采用比较Cp值法,即以目的基因UCA1 mRNA Cp值和内参基因GAPDH mRNA Cp值的比值R作为评价表达水平的标准,通过分析熔解曲线来判断PCR产物特异性,扩增出了单一产物,未出现其他异常波形,波的形状锐利,说明反应特异性好。
1.5统计学分析
数据分析使用SPSS 13.0统计软件,两组间阳性率的比较用χ2检验;偏态分布的数据采用中位数(M)及四分位间距(QR),组间比较采用Mann-Whitney U检验;P<0.05为有统计学意义。
2结果
2.1FQ-RT-PCR检测结果
见图1。S型曲线表示有mRNA扩增,阴性对照及阳性对照在45个循环结束时均未出现S型曲线属正常结果,其扩增产物的特异性通过熔解曲线判定见图2。UCA1和内参GAPDH两对引物在同一体系中均扩增出了单一产物,未出现其他异常波形,波峰形状锐利,说明反应特异性好 ......
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