游离脂肪酸诱导肾小管上皮细胞凋亡的实验研究(2)
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1.2.2分组方法实验共设立五组(1)软脂酸干预组设三组:以去脂牛血清白蛋白(d-BSA)为溶解软脂酸的载体,以加入培养液中软脂酸浓度的不同分为125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L,(各组载体d-BSA含量为0.125%、0.25%、0.5%);(2)对照组设两组:①正常培养液组②0.5%d-BSA+正常培养液组。
1.2.3硝酸还原酶法分别测定NO常规消化、收集NRK-52E细胞,按每孔1×105接种于6孔培养板内,置37℃、5%CO2培养24h,换无血清培养液培养24h同步化细胞,加入不同浓度软脂酸继续培养,在0h、24h、48h时收集细胞培养液各100μL,-20℃储存用硝酸还原酶法测定各组NO含量。
1.2.4原位末端标记(TUNEL法)检测细胞凋亡水平按每孔1×105接种于放有盖玻片的6孔培养板内,置37℃、5%CO2孵箱细胞爬片培养24h,换无血清培养液培养24h同步化细胞后,加入不同浓度软脂酸继续培养,分别在24h、48h进行实验:先用PBS洗涤2次,加入4%多聚甲醛室温下固定30min,按照tunel凋亡检测说明书操作。再用苏木素轻度复染正常细胞,凋亡的细胞胞质浓缩、胞核固缩呈黄色,正常细胞形态正常胞核呈蓝色。从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞。在400倍倒置显微镜下计数,凋亡率=凋亡细胞数/400倍视野中细胞总数×100%,每张片随机取9个视野,每个实验组观察5张片。
1.2.5免疫细胞化学法检测caspase-3按每孔1×105接种于放有盖玻片的6孔培养板内,置37℃、5%CO2孵箱细胞爬片培养24h,换无血清培养液培养24h同步化细胞后,加入不同浓度软脂酸继续培养,在48h进行实验:先用PBS洗涤2次,加入4%多聚甲醛室温下固定30min,PBS洗2次,蒸馏水洗3次,3%H2O2处理5min,蒸馏水洗3次,5%BSA封闭20min,甩去不洗加一抗4℃湿盒过夜,PBS洗3次,加二抗(生物素化羊抗兔IgG)37℃反应20min,PBS洗3次,加SABC37℃反应20min,PBS洗4次,DAB显色10~20min,苏木素轻度复染,蒸馏水洗 ......
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