nm23-H1与NGAL在宫颈癌中的表达与临床分析
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1 资料与方法
1.1一般资料
本研究所用标本为2008～2010年在本院行手术切除的宫颈癌组织。术前未经放、化疗，经病理检查均证实为宫颈癌，并由不同病理科医师复合后分类。患者年龄23~68岁，按年龄分组≤45岁的患者39例，>45岁的患者61例；宫颈鳞癌76例，腺癌24例；根据国际妇产科联盟(FIGO)分期标准进行临床分期：Ⅰ期62例，Ⅱ期38例。
1.2 免疫组化
鼠抗人nm23-H1单克隆抗体、生物素化山羊抗小鼠IgG和SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司，鼠抗人NGAL多克隆抗体购自美国CST公司。标本经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，以5μm厚度切片。切片常规脱蜡、脱水，30%H2O2︰蒸馏水以1︰10的比例混合，室温5min灭活内源性酶，蒸馏水洗3遍；将切片浸入0.01M枸橼酸盐(pH6.0)，微波炉加热至沸腾，间隔10min，反复两次进行热修复抗原；滴加5%BSA封闭液，室温20min；滴加一抗，室温孵育2h；滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，室温下30min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗三遍；滴加试剂SABC，室温下20min，PBS洗3次每次5min；DAB显色：取1mL蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后加至切片，室温显色20min；苏木素轻度复染，自来水充分冲洗；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察。用已知阳性的肝细胞癌组织作阳性对照，用PBS液代替一抗作阴性对照。
1.3 结果判定标准
以PBS代替一抗作为阴性对照，以试盒中所配的阳性切片为阳性对照，阳性表达为棕黄色颗粒。NGAL和nm23-H1主要位于细胞浆中，核呈弱阳性。采用双盲法在高倍视野下(×400)每个切片角及中央取5个高倍视野随机计数100个肿瘤细胞，各自计算100个癌细胞中阳性细胞所占的比例，取平均值。根据染色程度及染色细胞百分率进行评分：基本不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。着色细胞百分率<5%为0分，6%~25%为1分，26%~50%为2分，>50%为3分。两项评分标准得分相乘为其最终结果判定值。0~1分阴性，≥2分为阳性。
1.4 统计学处理
运用SPSS11.5统计软件进行统计分析，采用χ2检验进行差异统计学检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 基本资料
由于病例年龄分布较广，将所选病例以45岁为界，分为≤45岁组和>45岁组，两组年龄分别为(43.81±13.23)岁和(51.27±11.29)岁，差异有统计学意义(P<0.05)。在所有标本中，nm23-H1在48%的标本中呈阳性表达，而NGAL阳性表达率为61%。
2.2 NGAL和nm23-H1与年龄和临床分型的关系
由表1可知，nm23-H1无论是在不同年龄阶段还是在不同病理类型中阳性率表达率差异均无统计学意义(P>0.05)。而NGAL在>45岁的患者中有较高的阳性表达率(70.49%)，与≤45岁组比较差异有统计学意义(P<0.05)，在鳞癌中的阳性表达率也显著高于腺癌，差异有统计学意义(P<0.01)。而NGAL与nm23-H1在不同的临床分期中阳性表达率均无差异。
2.3 NGAL和nm23-H1与临床病理特征的关系
NGAL与nm23-H1基因在低分化肿瘤中的阳性表达率比中、高分化中高，在发生转移的肿瘤样本中阳性表达率也较未发生转移的标本阳性表达率高，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表2。
3 讨论
nm23基因是1988年Steeg等[5]用消减杂交法从鼠黑色素瘤细胞系分离出来的，nm23基因定位于染色体17q21.3，全长约8千个碱基，是一类结构和功能相对保守的基因大家族，其成员均含有4~6个极为相似的折叠亚单位。该基因由5个外显子和4个内含子组成，编码的蛋白产物即二磷酸核苷激酶(NDPK)，分子量约17KD。NDPK广泛存在，能催化多种反应，参与多种生物学活动，在细胞信号传递、细胞分化、维持细胞正常骨架等过程中，起着重要作用。它的两条链通过随机组合而形成等电点不同的系列同功酶，结构的多态性决定了其功能的多样性。NDPK改变还可引起染色体畸变，从而促使肿瘤转移。NDPK被认为至少参与两个重要的生物学过程：一是参与微管蛋白的聚合与解体；二是G蛋白介导的信号传递。NDPK通过酶联和高能磷酸键活化G蛋白，并以此方式调节大量G蛋白介导的细胞信号传导反应，进而参与发育及肿瘤的发展，另外NDPK的转磷酸作用产生的GTP能直接影响微丝、微管等细胞骨架蛋白的生物活动，通过参与调节细胞内微管系统的状态而抑制肿瘤的转移。
NGAL(neutrophil gelatinase associated lipocalin；Lipocalin 2)是最初从鼠肾细胞中发现的lipocalin家族成员之一，编码25kDa分泌性蛋白，在人的嗜中性粒细胞中以25kDa单体或46kDa同型二聚体存在，或是以与金属蛋白酶-9异源二聚体的形式存在。有研究证明NGAL蛋白除了存在于中性粒细胞之外，还在人体绝大多数正常组织中均有不同程度的表达。在肺泡细胞中NGAL的表达为阴性，而肺泡内巨噬细胞中NGAL的表达为弱阳性，支气管上皮中的产黏蛋白细胞则为强阳性表达。肝脏组织中仅仅是小叶内肝胆管的局部阳性着色，而肝细胞为阴性。正常胰腺的腺泡与大导管为阴性，而小叶内与小叶间导管局部为阳性表达。NGAL在女性生殖系统中的表达基本为阴性。正常的乳腺组织中导管上皮NGAL的表达为弱阳性，分泌乳汁的乳腺组织腺上皮细胞为中等阳性表达，而腺泡细胞和腺腔的大部分为阴性。随着NGAL基因在小鼠和大鼠中的同源物24p3和NRL(neu-related lipocalin)相继被证明是癌基因，近年来，对人类NGAL基因的研究已开始受到重视。研究发现NGAL蛋白在人类肿瘤中的表达模式具有明显的细胞及组织器官特异性。
目前对nm23-H1和NGAL的研究已经非常广泛，它们对肿瘤的转移和侵润有一定的影响，体外研究实验中发现当NGAL高表达时能抑制结肠癌细胞的转移能力，nm23-H1能抑制结肠癌的转移。但nm23-H1和NGAL的表达与其对转移潜能的影响并不是在所有肿瘤中都一样 ......
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