血管紧张素抑制剂对糖尿病心脏损伤的保护机制
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参见附件(4945KB，7页)。
1材料与方法
1.1 试剂和仪器
大鼠胰岛素(Insulin)、血管紧张素Ⅱ (angiotensinⅡ,AngⅡ)、血清肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB, CK-MB)、心肌肌钙蛋白I (cardiac troponin I, cTnI)ELISA试剂盒均购自美国ADL 公司；超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase SOD)、丙二醛(Maleic Dialdehyde MDA)、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒均购自南京建成公司；雷米普利(Ramipril Tablers)(5mg/片)购自昆山龙灯瑞迪制药有限公司；血糖仪采用美国强生OneTouch血糖仪；AFC标准品、Ac-DEVD-AFC荧光底物均购自BIOMOL 公司；Emax酶标仪，美国Molecular Devices公司]。
1.2 动物与分组
雄性Sprague Dawley (SD)大鼠40 只(由山西医科大学实验动物中心提供)，体重160～180 g，随机分为两大组：糖尿病组30只、对照组10只。其中糖尿病组经(普通饲料中加入10%猪油、10%蛋黄粉、20% 蔗糖)喂养4周后，一次性腹腔注射链脲佐菌素 (streptozocin， STZ，40 mg/kg，溶于柠檬酸缓冲液，pH 4.5)造模，造模成功后继续用高糖高脂饲料喂养；对照组经普通饲料喂养4 周后，给予腹腔注射等量柠檬酸缓冲液。注射STZ后1周经尾静脉采血测空腹血糖浓度(fasting blood glucose, FBG)，FBG≥16.7mmol/L者确定为糖尿病大鼠造模成功[4]。造模完成后将糖尿病组分成两组，灌胃生理盐水组[0.5mL/(kg·d)]15只、雷米普利水溶液(1mg雷米普利溶于5 mL生理盐水中)组[1mg/(kg. d)]15只，灌胃8周后观察大鼠的心功能、Ang Ⅱ等指标。
1.3 大鼠血糖浓度、血清胰岛素的测定
分别于造模前和注射STZ后1周及灌胃8周后进行大鼠断尾采血(采血前大鼠禁食12 h)，测定血糖浓度；同时取血静置后，3000 r/min离心10 min制备血清，按大鼠胰岛素ELISA试剂盒说明测定各时间点大鼠血清胰岛素含量。
1.4 大鼠心功能测定
大鼠腹腔注射20%氨基甲酸乙酯(1g/kg)麻醉，颈部切口后，经右侧颈总动脉插管至左心室，导管的另一端连接P50压力换能器，压力信号输入MS2000生物信号记录分析系统。导管插入左心室后稳定15～20min记录心功能各项参数：心率(HR)、左心室收缩压(leftventricularsystolicpressure，LVSP)、左心室内压上升最大速率(dp/dtmax)及左心室舒张末期压(left ventricular end diastolic pressure,LVEDP)。
1.5 AngⅡ、CK-MB、cTnI含量测定
抽取大鼠外周静脉血(肝素抗凝)0.5 mL，静置分层后，3000r/min离心10min，吸取上清制备血清；取心肌组织，按1mg组织加入10μL双蒸水，至冰上剪碎，匀浆，离心制备组织匀浆。分别按相关ELISA试剂盒说明测定血清AngⅡ、CK-MB、cTnI 含量及组织AngⅡ的含量。
1.6 心肌caspase-3活性测定
Caspase-3的活化是细胞凋亡的最终共有途径，其活性可以反映凋亡发生的程度。活性测定基本步骤如下[5]：取心肌组织，按1mg组织加入10μL 裂解液的比例进行裂解，置冰上剪碎，匀浆，离心。上清用考马斯亮蓝试剂盒测定蛋白浓度。取上清、反应缓冲液，底物(Ac-DEVD-AFC)加至ELISA板中水浴后，用酶标仪405nm下测定光密度值，同时ELISA板中加入不同浓度AFC作为标准品读数后作为标准曲线，各样品caspase-3活性结果以每毫克心肌蛋白单位时间分解底物产生AFC的速度来表示。
1.7 心肌组织MDA、SOD含量测定
取心肌组织，按1mg组织加入10μL双蒸水，至冰上剪碎，匀浆，离心取上清，用考马斯亮蓝试剂盒测定蛋白浓度，并分别按相关试剂盒说明测定MDA、SOD含量。
1.8 统计学处理
采用SPSS13.0统计软件对数据进行分析，实验结果以(χ±s)表示，组间均数比较采用单因素方差分析，样本均数组间比较采用q检验，P<0.05 时认为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 血糖浓度、血清胰岛素水平变化
饲养前及饲养4周时各组间FBG均无明显差异；注射STZ 1周后，糖尿病组FBG均>16.7mmol/L，且较对照组显著升高(P<0.01) ，表明糖尿病造模成功。糖尿病组大鼠血清胰岛素与对照组比较也显著升高(P<0.01)。见表1。结果提示，本实验建立的糖尿病大鼠模型具备高血糖、高胰岛素血症等2型糖尿病的主要临床特征，显示2型糖尿病模型建模成功。灌胃8周后，糖尿病生理盐水组、糖尿病雷米普利组FBG较对照组均显著升高(P<0.01)，糖尿病生理盐水组胰岛素较对照组显著升高(P<0.01)，糖尿病雷米普利组较对照组与糖尿病生理盐水组均无统计学差异(P>0.05)。结果提示，经过8周的灌胃药物，糖尿病雷米普利组的胰岛素水平虽较糖尿病生理盐水组无显著差异，但较对照组也无明显差异，说明灌胃药物发挥了一定作用。
2.2 大鼠血浆与心肌中AngⅡ含量的变化
与对照组相比，糖尿病生理盐水组血浆、心肌组织中AngⅡ含量均明显升高(P<0.01)，提示大鼠糖尿病时，血浆与心肌组织中Ang Ⅱ生成明显增加，Ang Ⅱ含量明显的升高，推测AngⅡ在糖尿病大鼠心脏损伤中发挥着很重要的作用；与糖尿病生理盐水组相比，糖尿病雷米普利组血浆中、组织中Ang Ⅱ含量明显降低(P<0.01)，见表2 ......
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