复方倍他米松抑制兔耳瘢痕增生与氧自由基作用的初步研究
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1.2 兔耳增生性瘫痕模型的制作
实验于2008年12月~2009年10月 。新西兰兔18只分笼普食饲养，适应性饲养1周后，参照文献[1-2]制作兔耳增生性瘢痕模型。动物称重后固定，以3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射进行麻醉，在兔耳腹侧中段沿长轴避开可见血管，切开皮肤全层，在皮肤与软骨之间锐性剥离，去除兔耳腹侧全层皮肤，制作1.0 cm×1.0 cm大小创面4~5个，创面间隔1.0 cm以上(图1)，止血后用无菌纱布包扎，清醒后自由进食。术后1d创面暴露，待其自行愈合，约4周后形成瘢痕样组织。
1.3 实验分组
所有标本均取自18只新西兰兔耳组织，共36例。其中，正常兔耳皮肤组织标本8例(正常对照组)；兔耳增生性瘢痕组织标本28例，随机分为复方倍他米松组(10例)、生理盐水组(10例)、空白对照组(8例) 4组动物月龄、雌雄比较差异均无统计学意义(P>0.05)。参照文献[1-3]，结合预实验摸索，复方倍他米松于术后6周将复方倍他米松液(40 mg/mL)分点注射于兔耳瘢痕样组织内，每处2~3点，总量0.3~0.4 mL，注射后瘢痕块局部苍白。生理盐水组应用生理盐水进行注射，剂量、注射方法同前。每周1次，3次为一疗程。
制模术后9周采集各组标本，用蒸馏水反复冲洗，去除表面血迹后，每份标本一分为二，一份作病理检查，一份置于清洁聚乙烯试管中加塞封闭，-70℃冰箱冻存待检。
1.4 形态学观察和检测指标
①观察瘢痕增生情况；②在显微镜下计数实验各组成纤维细胞；③HE染色切片在显微镜下用显微测量标尺测量瘢痕的相对增生厚度，以计算各组瘢痕增生指数[2]。见图1～2.
图1 术后即日 图2 术后第9周
1.5 丙二醛测定
组织称重后，冰浴上融化，小剪刀剪碎，按重量体积比加人9倍生理盐水，超声匀浆仪冰浴上匀浆，制成10%组织匀浆液，4℃, 3000 r/min离心15 min，取上清液，按试剂盒所附说明书测定丙二醛与总蛋白含量。用比浓度表示丙二醛含量(nmol/mgprot)。
1.6 统计学处理
所得数据输入SPSS11.5软件包进行统计分析，以均数±标准差表示。各组数据比较采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 大体形态学变化
术后30d创面上皮化，有高出周围正常皮肤的瘢痕形成。术后6~8周瘢痕增生显著，色红、质硬，其增生范围不超过原创缘 ;复方倍他米松局部治疗3周后，瘢痕颜色接近兔耳正常肤色，略高出皮面，表面平整，触之质软。
2.2 组织学变化
HE染色显示，兔耳增生性瘢痕空白对照组、生理盐水组真皮层中含大量排列致密、粗大的胶原纤维，排列紊乱，呈漩涡状或结节状，可见大量成纤维细胞。与空白对照组、生理盐水组比较，复方倍他米松组胶原纤维多为平行排列，成纤维细胞数量减少。
2.3 成纤维细胞密度与瘢痕增生指数变化
与正常皮肤组比较，空白对照组以及生理盐水组成纤维细胞密度增高( P<0.05 )，而复方倍他米松组差异无统计学意义(P>0.05 )；生理盐水组与空白对照组间成纤维细胞密度及瘢痕增生指数比较差异无统计学意义(P>0.05)；与空白对照组、生理盐水组比较，复方倍他米松组成纤维细胞密度及瘢痕增生指数显著降低，见表1 。
2.4 丙二醛含量变化
复方倍他米松组丙二醛含量明显增高(P<0.05)；生理盐水组与空白对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；与正常皮肤组比较，空白对照组以及生理盐水组丙二醛含量增高，见表2。
3 讨论
我们参照文献[1-2]制作了兔耳增生性瘢痕模型，结果显示大体形态学变化、组织学变化以及成纤维细胞密度与瘢痕增生指数变化符合文献报道[1-2]，表明动物模型复制成功。同时，我们观察发现，应用复方倍他米松局部治疗3周后，对兔耳增生性瘢痕具有很好的抑制作用。糖皮质激素治疗瘢痕的作用可能是通过抑制瘢痕组织中成纤维细胞增殖及其生物合成并促进成纤维细胞凋亡而实现[3-5]。但激素诱导成纤维细胞凋亡的途径尚需进一步研究，这对今后寻求瘢痕治疗的新措施可能有所帮助。
研究发现，活性氧具有重要的信号作用，特别是一定水平的超氧阴离子(O2-)或过氧化氢(H2O2)能够刺激不同类型细胞的增殖[6-7]，然而活性氧的过度产生会损伤DNA、蛋白和脂质，诱导细胞凋亡甚至引起坏死[8]，这些相对立的研究结果表明活性氧具有双相作用[9]。丙二醛是氧自由基与生物膜中的多价不饱和脂肪酸作用，发生脂质过氧化反应生成的终产物，可用作间接检测氧自由基水平的指标。国内学者的研究证实，氧在创伤愈合中起着重要作用。在创面的肉芽组织内，缺氧环境刺激巨噬细胞产生生长因子，促进成纤维细胞合成血管内皮基质。在我们的实验中，空白对照组比正常皮肤组的成纤维细胞密度和丙二醛含量明显增高(P<0.05)，提示兔耳瘢痕增生块的发生可能与氧自由基适度增加刺激成纤维细胞增殖有关。同时我们也发现，与空白对照组、生理盐水组比较，复方倍他米松组成纤维细胞密度显著降低(P<0.05)，而丙二醛含量明显增加(P<0.05)。这可能是因为复方倍他米松局部注射诱发兔耳瘢痕增生块内氧自由基进一步产生从而诱导成纤维细胞凋亡，进而引起成纤维细胞密度降低。已有研究表明[10]，复方倍他米松局部注射能够抑制增生性瘢痕局部小血管增生，这将加重组织缺血、缺氧，并因此可能引起瘢痕局部黄嘌呤氧化酶途径产生的活性氧增多[11]。
综上所述，复方倍他米松局部注射引起兔耳增生性瘢痕组织中氧自由基水平进一步升高，通过对瘢痕局部氧自由基水平的调节以诱导成纤维细胞凋亡可能有助于防治瘢痕过度增生，但尚需深入研究以获取更多依据加以验证。
[参考文献]
[1]李荟元，刘建波，夏炜，等.增生性瘫痕动物实验模型的建立与应用[J]. 中华整形外科杂志，2001,17(5)：275.
[2] Morris DE，Wu L，Zhao LL, et al. A cute and chronic animal models for excessive dermal scarring: quantitative studies[J]. Plast Reconstr Surg，1997，10(7):674-681.
[3]王韶华，朱世泽，吴文艺，等.水飞蓟宾对体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响[J].中国美容整形外科杂志，2011，22(2)：114-119.
[4]鲍卫汉，徐少骏.激素治疗瘢痕的机理研究[J].中华外科杂志，2000 , 38(5):378-381.
[5]卫俊霞，冯光珍，孙红，等.氢化可的松对体外培养的皮肤成纤维细胞增殖及胶原合成的影响[J]. 第四军医大学学报，2004, 25(19)：1785-1787.
[6] Sen CK. Antioxidant and redox regulation of cellular signaling: introduction[J] ......
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