后循环缺血兔大脑后分水岭区皮质MMP-9和TIMP-1表达的实验研究(2)
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参见附件。
1.2 样本提取阶段
将上述兔分成盗血1d组、盗血3d组和对照组，每组10只，对照组饲养12周后处死，后循环盗血组分别在术后第1天、第3天处死，快速断头取脑，脑组织在生理盐水中冲洗后，分别取右侧分水岭区皮层置入无菌冻存管，迅速放入液氮罐，深低温保存待检。
1.3 实验室检测阶段
总RNA抽提：取绿豆大小的组织，放入加有800μL TRIzol的5mL离心管(RNA酶free)中，用组织高速分散器匀浆后，在管中加入160μL氯仿，盖紧管盖，用手混匀，使体系成粉色乳状后，12000g离心15min；小心移取上清约400～450μL至新1.5mL管(RNA酶free)中，加入450μL异丙醇，混匀，置于-20℃冰箱助沉30min，12000g离心10min。小心地彻底弃上清。在离心管中加入1mL冰75%乙醇，轻弹管底使沉淀悬浮起来，12000g离心5min。小心地彻底弃上清，并于沉淀处画圈标记。RNA干燥后，用30μL DEPC处理过的去离子水溶解后取1μL样本与9μL 1X上扬缓冲液混匀后上样电泳，其余于-80℃保存。TIMP-1引物序列：上游P5：5’-GCTGCTGCTGCTGTGGCTGGTAG，下游P5：5’-GCTGCTGCTGCTGTGGCTGGTAG；MMP-9引物序列：上游P5：5’-CGGAGACGGGGGAGCTGGATAATG，下游P3：5’-GCGCGGCAGGTCTTCGGAGTAGTT。内参照18s引物序列：上游5’-AGTCGCCGTGCCTACCAT-3’，下游5’-CGGGTCGGGAGTGGGTAAT-3’。采用试剂TAKARA DRR037：PrimeScript®RT reagent Kit Perfect Real Time进行RNA的反转录，PCR扩增。定量检测，荧光定量检测结果采用slan荧光定量5.1软件进行分析。
1.4 统计学处理
数据均以平均值±标准差表示，统计方法为参数分析方式。所有统计结果均采用SPSS13.0软件中的完全随机设计的单因素方差分析模块(pos-hocone-way ANOVA)，比较多重均数。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 实验动物结果
盗血实验组均采用右锁骨下动脉结扎法建立后循环缺血模型，无死亡、无神经系统功能障碍及行为等方面异常。实验中发现，右锁骨下动脉结扎法建立的后循环缺血模型是可行的，具有重复性。
2.2 实验数据与分析(表1)
以上各组数值均为所测值与18s(内参照)的比值，故没有单位；MMP-9组间比较，差异无统计学意义(F=0.033，P=0.968>0.05)；TIMP-1组间比较差异无统计学意义(F=0.812，P=0.455>0.05)。
3 讨论
MMP-9是一种相对分子质量为92KD的锌依赖性内肽酶，通过作用于Ⅳ型明胶、层粘连蛋白和纤维粘连蛋白，在细胞外基质的降解和重塑中起着重要的作用[21]。TIMP-1是MMP-9的特异性抑制剂。MMP-9与TIMP-1的动态稳定对于维持细胞外基质的稳态非常重要；在脑缺血、缺氧、炎症等病理诱因下，这一稳态被破坏，MMP-9过量产生，血管通透性增加，细胞外基质被过度降解，导致脑水肿等发生。而动脉粥样硬化下的脑缺血的发生，其侧支循环的建立状况直接影响到缺血区血液供应的恢复程度和速度，改善组织细胞的氧和营养物质的供应，有利于缺血性脑血管疾病的治疗和康复。同时，侧支循环的建立主要在于动脉生成。动脉生成是指原有的阻力型小动脉在动脉闭塞等病理条件下，管腔扩大，管壁重塑，转变为供血型侧支动脉的过程，其所形成的动脉能够有效地恢复动脉阻塞所致缺血区的血液供应[2，3]。基质金属蛋白酶及其抑制剂能够使细胞外基质降解、促进内皮细胞动员而利于细胞迁移，参与动脉生成。因此，通过对脑缺血下MMP-9和TIMP-1表达的实验研究有助于探讨其在侧支循环建立过程中的分子机制。
近些年来有关MMP-9在急性脑梗死中的表达、作用的研究非常多，与之相应的脑缺血模型(如大脑中动脉盗血模型MCAO)报道也比较多，为基础和临床研究提供了很多的实验依据。而右侧锁骨下动脉盗血模型[4]，模拟了临床动脉粥样硬化患者由于椎基底动脉狭窄或闭塞导致的后循环低灌注状态，用来研究椎基底动脉系统(即后循环)缺血下分子机制，为临床有效防治该病提供新的依据。
动脉粥样硬化是导致大动脉狭窄或闭塞的重要原因，在右锁骨下动脉结扎后，血流动力学异常，后循环灌注压下降；分水岭区为位于大脑皮质动脉供血区之间、基底节区小动脉供血区之间的边缘带组织，低血流灌注下更易产生缺血、梗死，同时由于前循环的部分代偿减弱了缺血强度，加之时间窗的选取不足以表现出MMP-9的变化，结合例数较少，因此在本次研究中，MMP-9在对照组、盗血1d组和盗血3d组的表达呈现了逐渐升高的趋势，但是各组间比较在统计学上没有显著性意义。与近年来文献中有关MMP-9的动态变化相符合[5-8]。TIMP-1在盗血第一天达到了很高的表现，之后逐渐下降，但仍比对照组高，而在统计学上没有显著性差异。
综合以上分析，有关右侧锁骨下动脉盗血模型下的更多的分子机制的表现有待今后通过增加样本量和取样时间窗，引入基质金属蛋白酶家族中的其他成员，进行进一步深入研究。
[参考文献]
[1] MunBryce S，Rosenberg GA.Celatinase B modulates selective opening of the Blood-brain barrier during inflammation[J].Am J Physiol，2002，274(5 pt 2)：R1203.
[2] Hershey JC，Baskin EP，Glass JD，et al. Revascularization in the rabbit hindlimb： dissociation between capillary sprouting and arteriogenesis[J] ......
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