新城疫病毒(NDV)对卵巢癌细胞株(SKOV-3)的杀伤作用(2)
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参见附件。
1.3 结果判定
吖啶橙染色后荧光显微镜下见NDV作用的癌细胞细胞质与细胞核呈致密浓染的黄绿色荧光或见黄绿色碎片，亦有少数黄绿色碎片，染色质浓缩到核边，核碎裂，有的细胞形成合胞体；PI染色荧光显微镜下见正常活细胞核被PI着染呈红色；早期凋亡细胞胞核浓缩，染色加深，或核染色质聚集于核膜一边，呈新月状；晚期凋亡细胞胞核碎裂成大小不等的原形小体，并被细胞膜所包绕，即凋亡小体。病毒作用24h后电镜下观察细胞中发现凋亡小体，同时也见典型的坏死细胞。
1.4 统计学方法
采用SPSS统计软件进行数据处理，运用配对t检验或χ2检验，P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 新城疫病毒(NDV)对人卵巢癌细胞株(SKOV-3)不同作用时间杀伤作用
肿瘤细胞贴壁率光镜选择3个视野观察肿瘤细胞贴壁率，随NDV作用时间的延长，肿瘤细胞萎缩、脱落、最后悬浮，贴壁率显著下降(表1)。
2.2 两组肿瘤细胞存活率与贴壁率相比
肿瘤细胞存活率与贴壁率相比，存活率高于贴壁率，实验组与对照组存在显著性差异(P<0.01)。
2.3 肿瘤细胞的光镜观察
NDV病毒处理24h后人卵巢癌细胞株SKOV-3见细胞体积减少细胞膜皱缩，形态不规则，溶解核小体出现，核染色质浓缩在核膜下或核的一边， 可见细小的碎片，出现大面积细胞凋亡。未经NDV病毒处理的SKOV-3细胞只见少许凋亡细胞。
2.4 电镜检查
感染病毒48h细胞作超薄切片、透射电镜观察，见NDV作用后SKOV3细胞形态改变，肿瘤细胞感新城疫病毒后，可引起明显的细胞超微结构变化：细胞胞浆内均富含不同发育阶段的病毒颗粒，完整病毒粒直径约100nm，并形成包涵体；成熟病毒粒子排列成晶格状，线粒体肿胀、细胞膜溶解；亦见到核膜结构完整，但核染色质浓缩、成块、边聚、滑面内质网扩张的细胞，尚可见到大量的病毒空衣壳和未包装的病毒核物质。见图1。
图1 NDV 诱导SKVO-3细胞发生细胞凋亡的形态改变(×50 000)
A：未感染NDV的SKOV-3细胞； B：NDV作用48h的SKOV-3细胞；C：未感染NDV的SKOV-3细胞；D：NDV作用48h的SKOV-3细胞
2.5 AO-PI染色法检测凋亡细胞
AO-PI染色法检测凋亡细胞感染病毒24h的细胞经AO-PI染色法后，肿瘤细胞核呈蓝色，凋亡细胞核呈棕褐色。新城疫病毒作用24h凋亡细胞阳性指数(AI)为9.9%，48h凋亡细胞阳性指数(AI)为17.8%。
3 讨论
NDV 是新城疫病毒(NDV)，属副黏病毒科腮腺炎病毒属成员，属反义负链RNA病毒，由 Doyle[2]在1927 年首先发现和分离报道。本研究将NDV与人卵巢癌细胞株混合，研究其对人卵巢癌细胞株和正常人卵巢上皮细胞的生长抑制作用。结果表明NDV对人卵巢癌细胞有抑制作用，对人正常卵巢上皮细胞作用不明显，提示NDV在体内可能有安全性好、副反应小的优越性。NDV对绝大多数肿瘤有选择性直接杀伤作用，国外将NDV应用于临床未发现毒性反应。本实验进一步确定新城疫病毒的抗肿瘤作用，直接用新城疫病毒观察其体外抗肿瘤作用，研究表明，新城疫病毒在体外可抑制瘤细胞的存活。NDV对卵巢癌有直接的抑瘤作用，使NDV有望在控制卵巢癌微小残余灶、延缓复发、提高生存期和生存质量等方面发挥作用。NDV具有直接诱导肿瘤细胞凋亡及激活免疫功能细胞，NDV诱导肿瘤细胞凋亡或瘤体消退的机制尚不十分清楚，可能的解释：①NDV直接作用于肿瘤细胞产生细胞毒作用，病毒选择性地作用于肿瘤细胞，对正常组织细胞不起作用。Tzadok-David等[3]研究了NDV对Burkitt淋巴瘤Daudi细胞的破坏作用，发现NDV对肿瘤细胞的裂解机制可能与细胞膜的通透性增加有关。② NDV蛋白与肿瘤细胞膜部分或完全融合，诱导和加强宿主的细胞免疫及体液免疫杀伤肿瘤细胞。③NDV对体内外巨噬细胞抗肿瘤活性具有很强的激活作用；NDV能选择性地感染肿瘤细胞并在其中复制，不感染正常细胞。本实验利用NDV-D90强毒株作用于人卵巢癌SKOV3，发现NDV有明显的抑制肿瘤作用。蒋文军等选用NDV Lasota毒株感染多个人恶性肿瘤细胞株，亦得出相同结果。
综上，新城疫病毒(NDV)促进SKOV3卵巢癌细胞凋亡，对卵巢癌组织具有溶瘤作用，使新城疫病毒成为手术、化疗之外的新选择。
[参考文献]
[1] 成军.抗肿瘤基因治疗的目的基因选择[J]. 国外医学：肿瘤学分册，1994，21(1)：6.
[2] 陈兆.医学分子生物学[M].武汉：武汉大学出版社 ......
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