TGF-β1、CTGF在胆管缺血性损伤修复过程中的表达及意义(2)
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1 材料与方法
1.1 材料及试剂
SPF级SD雄性大鼠100只(温州医学院实验动物中心提供)，体重150～200 g；TGF-β1多克隆抗体(Santa Cruz公司)；羊抗兔IgG多抗、兔抗羊IgG多抗(上海史瑞可生物科技有限公司)；5%～10%羊血清；PBS；羊抗鼠CTGF多抗(美国PeproTech公司)。
1.2 方法
100只SPF级SD大鼠随机分为对照组及实验组，实验组根据术后处理时间不同分为4个亚组(术后1、3、5、8周处理组)，每组20只。实验组用2枚显微血管夹(宽0.2 cm)夹闭十二指肠上缘长约0.4 cm的胆总管90 min，对照组仅暴露胆总管未夹闭。对照组于术后1周取胆总管组织，实验组于术后1、3、5、8周取夹闭处中间胆总管组织，石蜡包埋，行HE及VG(苦味酸-酸性品红法)染色，观察其病理改变；免疫组化技术检测两组胆管组织中TGF-β1、CTGF的阳性表达部位，并采用病理图像分析系统计算阳性细胞数。
1.3 免疫组化评定标准
细胞质或核内见淡黄色颗粒为阳性细胞。细胞着色强度分级：“-”为阴性细胞；“+”为细胞核和/或质染成淡棕黄色；“+++”为深棕黄色，“++”则介于两者之间。每张切片高倍镜下(×400)随机选取5个视野，计数每个视野阳性细胞数，取其均数进行定量分析[5]。
1.4 统计学方法
数据采用SPSS 16.0软件作统计学处理，TGF-β1和CTGF阳性表达细胞的数量相关性采用Spearman秩相关分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 胆管胶原纤维结构变化
VG染色镜下胶原纤维呈红色，对照组分布稀疏，纤维较细；实验组各期胶原纤维粗大，密集成束。见图1。
A：对照组；B~D：术后1、3、7周组
2.2 免疫组化检测结果
TGF-β1及CTGF在术后各期均有显著表达，但术后各期表达比较差异无统计学意义(P > 0.05)；TGF-β1及CTGF在正常对照组无表达或者仅轻微表达，与术后各期比较TGF-β1及CTGF表达差异有统计学意义(P < 0.01)；Spearman相关分析：实验组术后各期TGF-β1和CTGF的表达呈正相关性，随着手术时间的延长，两者均有递增趋势，见图2、图3，TGF-β1与CTGF表达相关性见表1。
注：实验组TGF-β1与CTGF的表达与对照组比较，差异有统计学意义(*P < 0.01，**P < 0.01)；实验组组间TGF-β1与CTGF的表达差异无统计学意义(P > 0.05)；Spearman相关分析：实验组TGF-β1和CTGF的表达呈正相关(r = 0.246，P < 0.05)
3 讨论
国内外研究表明，胆管损伤时所造成的胆管缺血狭窄涉及多种细胞、细胞因子和细胞外基质之间错综复杂的相互作用[6，7]。本实验采用钳夹法建立了大鼠胆管缺血狭窄模型[8]。结果显示正常对照组大鼠TGF-β1及CTGF无表达或者轻微表达，与术后各期比较TGF-β1及CTGF表达差异有统计学意义(P < 0.05)；实验组疏松结缔组织中可见大量毛细血管及炎性细胞浸润，而对照组未见明显的炎性细胞浸润。提示TGF-β1、CTGF是由术中产生的大量炎性细胞合成分泌。另外实验组术后出现大量的炎性细胞浸润，提示慢性炎症亦是胆管瘢痕狭窄的重要因素。
TGF-β1与瘢痕形成密切相关，是一种所占比例最高、活性最强、最有代表性的生长因子[9]。本实验过程中，胆管愈合的1、3、5、8周TGF-β1均表现为局部持续较高浓度表达，而正常对照组TGF-β1无表达或仅轻微表达，实验进一步证明TGF-β1可能是胆管瘢痕增生的主要原因；CTGF是新发现的在纤维化病程中发挥重要作用的生长因子，能促使Ⅰ型和Ⅲ型胶原的合成，被认为是其他分子诱导的生物学作用的调节者和辅助介导因素。本实验过程中，胆管愈合的1、3周CTGF明显表达，胆管愈合的5、8周则表现为持续的强表达，而正常对照组CTGF无表达或仅轻微表达，从而证明CTGF亦是胆管瘢痕增生的重要原因；Spearman相关分析可得，TGF-β1、CTGF在实验组术后各期呈正相关表达，随着手术时间的延长，两者均表现为持续增强表达。
综上所述，细胞因子TGF-β1、CTGF在胆管缺血引起胆管狭窄过程中发挥着重要作用，是胆管狭窄形成的主要因素；其次，实验证明炎性细胞浸润亦是胆管缺血引起胆管狭窄过程的重要影响因素[10]。可见，TGF-β1、CTGF的持续高表达及大量的炎性细胞浸润是胆管缺血引起胆管狭窄的主要病理机制。因此，设法抑制TGF-β1、CTGF的过度表达及活性，减少炎症反应的量和程度，将有助于预防和减少术后胆管瘢痕增生和管腔狭窄的发生，对防治良性胆管狭窄提供了一条新的思路和途径。
[参考文献]
[1] 赵德芳，张彤，赵利军，等. 大鼠胆管缺血狭窄模型的构建[J]. 中国组织工程研究与临床康复，2011，15(18)：3351-3353.
[2] 王向昱，李立军，郑志强. 良性胆管狭窄发生的分子学机制及生物治疗[J]. 中华肝胆外科杂志，2011，17(6)：518-520.
[3] 陶灵，李世荣，刘剑毅，等. CTGF刺激人增生性瘢痕成纤维细胞STATs蛋白活化的状况[J]. 中国美容医学，2008，17(4)：521-523.
[4] 李立军，王向昱，张普，等. TGF-β1及CTGF在胆管缺血性损伤修复过程中的表达及意义[J] ......
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