余甘子对大鼠酒精性脂肪肝的炎症抑制作用研究(2)
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1.2.2 组织学分析 肝脏组织固定于10%的磷酸盐缓冲的福尔马林中，然后以石蜡包被制成5 μm厚的组织切片。切片使用苏木精-伊红双染法进行肝脏内脂肪堆积的评分分析。脂肪堆积评分标准：脂肪颗粒占背景0～25%的区域为1分；25%～50%为2分；50%～75%为3分；75%以上为4分。
1.2.3 RNA提取和反转录 大鼠肝脏组织经液氮研磨后使用SV Total RNA试剂盒提取总RNA，随后根据SYBR ExScript RT-PCR试剂盒的说明将总RNA反转录为cDNA，置于-20℃下保存。
1.2.4 荧光实时定量PCR(Real-time PCR) Real-time PCR按照SYBR ExScript RT-PCR建议的体系和条件于Applied Biosystems Prism 7900 Real-time PCR仪器上完成，所有引物的退火温度均优化至60 ℃。人类GAPDH作为内参照进行同步PCR扩增(表1)。Real-time PCR结果使用2-ΔΔCt法进行分析并以对照组百分数的形式于结果中表示。
1.2.5 免疫印迹分析(Western blot) 按照总蛋白试剂盒的方法提取肝脏组织总蛋白后使用BCA法(Bio-Rad)定量，每个样品取150 μg总蛋白进行免疫印迹分析。
1.3 统计学处理
实验结果采用SPSS 11.0软件进行统计学分析。采用方差分析，两两比较时采用SNK法，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 余甘子对酒精肝内肝损伤的保护
大鼠经高脂混合乙醇饲料喂养8周后，与正常组相比，肝脏小叶中央静脉附近出现明显的细胞坏死和炎症部位，同时整个肝脏中可见大量脂肪颗粒堆积。加入余甘子协同处理后，肝内坏死及炎症部位显著减少，脂肪堆积评分分值明显下降(图1及表2)。此外，相比较于对照组，酒精肝大鼠血清中ALT和AST的表达量显著上升(P值分别为0.005 8和0.007 9)，提示肝损伤的发生。加入余甘子协同处理后，大鼠血清中ALT和AST下降到与对照组大鼠接近的水平(P值为0.033 1，表2)。
2.2 余甘子对肝内促炎症因子的影响
与对照组相比，酒精肝大鼠肝内TNF-α、IL-1β和COX-2的mRNA及蛋白表达水平均显著上升(P值分别为0.000 7、0.007 2和0.000 3)，提示肝内存在相当程度的炎症反应。加入余甘子协同作用后，相比较于酒精肝组大鼠，三种促炎症因子的表达水平均有显著下降，其中TNF-α和IL-1β下降到接近对照组的水平(P值分别为0.006 4、0.008 8和0.003 9，图2)。
3 讨论
本研究通过参考Tipoe GL等[8]的酒精性脂肪肝建模方法，利用高脂肪饲料辅以酒精自由喂饲8周成功建立了雌性大鼠酒精肝模型。从血清生化指标、肝脏组织学检验和肝内炎症因子的表达来看，本模型基本复制了酒精肝中各种标志性病理事件。同时相比于雄性大鼠，雌性大鼠对于酒精肝的耐受能力更差，所以本模型完全以雌性大鼠作为研究对象，以期获得更为明显的酒精肝损伤。在诱导酒精肝形成的8周内我们通过每日注射0.06 mL/g的余甘子萃取物作为协同处理，有效地减少了肝脏内细胞坏死、炎症部位的出现和脂肪颗粒的堆积，同时亦将血清内提示肝损伤的ALT和AST表达量降低到了对照组水平，提示余甘子对由酒精肝引起的肝脏损伤具有有效的保护作用。在分子生物学的角度上，酒精肝大鼠中TNF-α、IL-1β和COX-2的表达水平明显升高，提示酒精肝中肝内发生了严重的炎症反应。而余甘子的协同处理从基因转录水平和翻译水平上均显著降低了此三种促炎症因子的表达水平，亦反映了余甘子对炎症反应的抑制作用。
虽然酒精肝的发病机制非常复杂，现在并未完全研究清楚[9]，但是一般认为在摄入乙醇后，在肝内乙醇脱氢酶(ADH)、细胞色素P450 2E1(CYP2E1)和过氧化氢酶(catalase)三套系统的作用下乙醇被氧化为乙醛，然后在线粒体中通过乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase)的作用转化为醋酸盐。这些代谢过程中会在肝细胞、炎症细胞及非实质细胞中产生对机体有害的自由基(ROS)，提高体内氧化应激水平，进而攻击细胞内的一些细胞器，例如线粒体、内质网和细胞核等，引起炎症反应和启动细胞凋亡通路。在ROS的攻击下，肝脏内的Kupffer细胞会释放出一些促炎症因子，例如TNF-α、IL-1β和COX-2，引起炎症反应、纤维化反应以及进一步促进ROS的释放，恶化已有的酒精肝损伤[10]。余甘子对于肝脏细胞内炎症的抑制不仅阻止了炎症损伤和细胞凋亡坏死，也明显改善了肝内脂肪堆积，扭转了酒精肝的病理进程。但是余甘子是否能够改善肝内氧化应激以及纤维化水平需要进一步的研究。
本研究结果证实在诱导酒精肝的同时加入余甘子同步处理可以明显改善肝脏内损伤，降低肝内炎症反应，起到促进酒精肝恢复的效果。
[参考文献]
[1] 庄辉，张华捷. 酒精性肝病的流行病学[J]. 胃肠病学，2003，8(5)：294-297.
[2] Rehm J，Mathers C，Popova S，et al. Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders[J]. Lancet，2009，373(9682)：2223-2233.
[3] 厉有名. 中国酒精性肝病的研究现状[J]. 现代消化及介入诊疗，2007， 12(4)：235-236.
[4] Mandrekar P，Szabo G. Signalling pathways in alcohol-induced liver inflammation[J] ......
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