阿托伐他汀对对比剂肾病大鼠肾脏细胞凋亡及FAS/FASL表达的影响(2)
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[Key words] Atorvastatin； Contrast—induced nephropathy； Apoptosis； Rat； FAS/FASL
近年来他汀类药物对对比剂肾病(contrast—induced nep—hropathy，CIN)的预防作用受到极大关注。国内外许多研究表明，阿托伐他汀术前给药可以减少术后CIN的发生，并存在剂量依赖性效应[1]。但他汀类药物预防CIN的机制未完全阐明。
细胞凋亡参与多种肾脏疾病的发生、发展及修复过程[2]。对比剂在肾小管和集合管高度浓缩，可直接损伤上皮细胞，诱导其凋亡。细胞凋亡受多种因素调控，受体介导的凋亡途径中，FAS/FASL系统最具代表性。他汀类药物是否通过影响肾脏的细胞凋亡及凋亡相关蛋白FAS、FASL来预防CIN的呢？本研究通过建立对比剂肾病大鼠模型，观察不同干预组肾脏细胞凋亡的情况及FAS、FASL表达的情况，以进一步探讨他汀类药物对CIN的保护机制。
1 材料与方法
1.1 实验对象
健康雄性SD大鼠(徐州医学院动物中心提供)32只，清洁级，体重(200±10) g。
1.2 主要试剂及器材
阿托伐他汀(立普妥，辉瑞制药有限公司)；吲哚美辛(美国Sigma公司)；N—硝基—L—精氨酸甲酯(美国Sigma公司)；泛影葡胺(上海旭东海普药业有限公司)；TUNEL试剂盒(罗氏公司)；一抗为兔抗FAS/FASL抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；二抗为生物素化羊抗兔IgG(武汉博士德生物工程有限公司)；DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；全自动生化分析仪(Olympus AU 2700型)；台式高速离心机(LDZ5—2型)；电热恒温培养箱(HG303—3型)；Olympus显微摄像系统(日本Olympus公司)。
1.3方法
1.3.1 分组方法 实验随机分为4组，每组8只：正常组(生理盐水灌胃、股静脉注射生理盐水)；实验对照组(生理盐水灌胃，股静脉分别注射吲哚美辛、N—硝基—L—精氨酸甲酯和生理盐水)；造模组(生理盐水灌胃，股静脉分别注射吲哚美辛、N—硝基—L—精氨酸甲酯和泛影葡胺)；他汀组(阿托伐他汀灌胃，股静脉注射同造模组)。
1.3.2 建立对比剂肾病大鼠模型[3] 造模前大鼠禁水12 h，自由进食。称重后按10%水合氯醛 0.32 mL/100 g 腹腔注射麻醉，平卧位备皮、酒精消毒后分离左股静脉，插入留置针并固定，每隔15分钟分别注射吲哚美辛(1 mg/100 g)、N—硝基—L—精氨酸甲酯(1 mg/100 g)和泛影葡胺(10 mL/kg)。
1.3.3 药物干预 他汀组于造模前3天、造模当天及造模后3 d连续应用30 mg/(kg·d)[4]阿托伐他汀灌胃；其余3组均使用等量生理盐水灌胃。
1.3.4 标本留取 造模前及造模后48 h经大鼠眼底静脉丛采血1 mL，离心取上清液。造模后72 h杀鼠取右肾，10%中性甲醛固定、石蜡包埋、切片。
1.3.5 指标检测 ①全自动生化分析仪检测造模前后各组大鼠SCr。②原位检测细胞凋亡：采用罗氏分装TUNEL试剂盒，根据说明书略做改良。切片厚约4 μm，常规脱蜡至水，经3%H2O2处理、蛋白酶K消化后，加入TUNEL反应液和转化剂—POD，4℃过夜，DAB显色，光镜观察凋亡信号，切片随机选取5个高倍镜视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞百分率，胞核中有棕色颗粒者为阳性细胞。③免疫组化检测FAS、FASL：一抗为兔抗FAS/FASL抗体；二抗为生物素化羊抗兔IgG。采用SABC免疫组化检测，经DAB显色后，光镜下观察结果，每例分别随机选取5个高倍视野，计算每个视野内染色区域的光密度值。
1.4 统计学处理
实验数据采用SPSS 16.0统计学软件进行处理。计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组内比较采用配对t检验，组间比较采用方差分析(ANOVA)。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1造模前后各组大鼠血肌酐值
造模组血SCr造模前较造模后升高> 25%，且造模后C组血SCr较各组有所升高(P < 0.05)。
2.2 TUNEL结果
光镜下，造模组较A、B两组肾脏凋亡细胞数明显增多，阳性细胞百分率增高(P < 0.05)，D组(他汀组)较C组(造模组)凋亡细胞数减少，阳性细胞百分率减少(P < 0.05)。
2.3 免疫组化结果
C组(造模组)较A、B两组肾脏FAS及FASL的表达显著增强(P < 0.05)，D组(他汀组)较C组(造模组)肾脏FAS和FASL的表达减弱(P < 0.05)。
3 讨论
CIN指使用对比剂48 h内发生的无其他原因可解释的急性肾功能损害性疾病，通常以血清肌酐上升超过44.2 μmol/L(即0.5 mg/dL)或较造影前的基础水平升高超过25%为诊断标准[5，6]。本研究中，大鼠血液采集的时间点为造模后48 h，结果示造模组血SCr较造模前水平升高(P < 0.05)，且上升幅度均大于造模前25%，符合上述诊断标准。
对比剂肾病的发病机制尚未明确，高浓缩的对比剂不仅能直接损伤肾小管(对比剂使肾小管上皮细胞Ca2+内流增加，胞浆内Ca2+浓度增高，细胞骨架破坏)，诱导细胞凋亡，而且CIN发病过程中产生的氧自由基、炎症因子等也参与了细胞凋亡[8] ......
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