RNAi干扰HMGB1基因对乳腺癌细胞MCF—7增殖的影响(2)
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1.4 Western blot检测HMGB1蛋白表达
收集各组细胞，定量后取总蛋白40 μg，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，经转膜、封闭，加HMGB1 单克隆抗体(稀释度1∶500)辣根过氧化酶标记二抗(Pierce Biotechnology，美国)化学发光试剂增强反应，X光片曝光显影，经ABB成像分析系统扫描(ABI公司，美国)，以目的蛋白灰度值与内参β—actin灰度值的比值反映HMGB1的表达水平。
1.5 MTT检测细胞增殖
选择干扰效率较高的pRI—GFP—1组，细胞转染0 h、48 h、72 h后，以每孔1 000个分别接种各组细胞于96孔细胞培养板，同时设立空白对照组，培养24 h后，每孔加20 μL的MTT溶液，37℃，5%CO2饱和湿度下孵育4 h，吸出孔内培养液，每孔加二甲基亚岚(DMSO)150 μL，酶标仪检测每孔吸光度值(A)。
1.6 统计学分析
采用SPSS 15.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，两两比较采用t检验，P < 0. 05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 WB检测各组中HMGB1蛋白的表达
转染48 h、72 h pRI—GFP—1组、pRI—GFP—2组HMGB1蛋白水平较pRI—GFP—Neg组及空白对照组明显减低(P < 0.05)， 且pRI—GFP—1组干扰效率优于pRI—GFP—2组；pRI—GFP —Neg组与空白对照组各时间点蛋白表达差异比较无统计学意义(P > 0.05)。
2.2 MTT法检测细胞的增殖
转染后48 h、72 h、96 h、120 h pRI—GFP—1组较pRI—GFP—Neg及细胞对照组生长明显受到抑制，差异有统计学意义(P < 0.05)，转染后96 h细胞生长抑制率达到最高。
3 讨论
HMGB1是与染色体结合的非组蛋白成分之一。该蛋白基因定位于人染色体13q12 带，共含有5 个外显子，相对分子质量为25 000，由215 个氨基酸组成，属于HMG 蛋白超家族。HMGB1与DNA结合，可稳定核小体形状，作为基因和组织特异性的转录调控因子有调节转录活性的作用。近来的研究表明，多种肿瘤和未成熟细胞均可以产生高迁移率族蛋白HMGB1，与癌细胞侵袭和转移密切相关。
杨晓文等研究表明，HMGB1在乳腺癌组织中的表达与肿瘤临床分期、病理分级、淋巴结转移及远处转移显著相关，但在细胞学的研究未见报道。前期实验已经验证了HMGB1在乳腺癌细胞系中是高表达的，本实验构建了含有U6启动子的HMGB1 siRNA质粒表达载体并转染入乳腺癌细胞系MCF—7中，RT—PCR及WB验证针对两个不同靶位点的两条siRNA干扰效率均达到60%，但是pRI—GFP—1的干扰效率要高于pRI—GFP—2，因此我们在生物学功能实验中选择pRI—GFP—1干扰质粒。研究结果表明，RNA干扰下调HMGB1基因后，MCF—7细胞增殖受到明显抑制，细胞生长曲线低平，缺乏指数增长特征。
HMGB1的生物学活性主要通过与其相应受体的相互作用而实现，其中RAGE是HMGB1的主要受体，通过与HMGB1高亲和力结合，通过激活p38 MAPK，p44/p42 MAPK，SAPK/JNK等信号通路促进细胞生长[6]。有研究显示HMGB1可以抑制p53抑癌活性，阻止细胞对损伤DNA的修复，过度活化Ras/ERK信号传导通路等，抑制HMGB1的表达可能通过以上受体依赖型途径减慢了细胞生长。HMGB1靶向siRNA抑制细胞增殖的具体分子机制还需进一步证实。
[参考文献]
[1] Pardo M， Garcia A， Thomas B， et al. The characterization of the invasion phenotype of uveal melanoma tumour cells shows the presence of MUC18 and HMG—1 metastasis markers and leads to the identification of DJ—1 as a potential serum biomarker[J]. Cancer ，2006，119(5)：1014—1022.
[2] Shah SN，Resar LM. High mobility group A1 and cancer：Potential biomarker and therapeutic target[J]. Histol Histopathol，2012，27(5)：567—579.
[3] Huang QX ......
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