小鼠PMX—IRES—Wnt5a逆转录病毒载体的构建及在3T3细胞中的表达(2)
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参见附件。
1.2 PMX—IRES—Wnt5a逆转录病毒载体的构建与鉴定方法
1.2.1 引物设计及合成 根据GenBank上鼠Wnt—5a的mRNA功能全长序列，采用Primer 5.0设计一对引物，并导入BamHⅠ和HindⅢ酶切位点，其引物序列如下：Sense： 5'—CCC A↑AGCTT GGCATCAAGGAATGCCAGTA—3' (HindⅢ)；Antisense：5'— CGC G↑GATCC GTACGTGAAGGCCGTCTCTC—3' (BamHⅠ)。
1.2.2 目的基因获取 RNeasy Mini试剂盒提取小鼠总RNA，采用OneStep RT—PCR试剂盒进行PCR扩增获得Wnt—5a基因产物，凝胶电泳后采用胶回收试剂Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0进行回收纯化，纯化产物进行测序鉴定。
1.2.3 重组逆转录病毒载体 将PMX—IRES—GFP逆转录病毒载体经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后，在T4 DNA连接酶作用下，与上述PCR纯化产物于4 ℃条件下12 h连接反应，将连接产物转化到DH5α中，细菌转化及克隆筛选，质粒少量提取，酶切鉴定(质粒采用BamHⅠ和HindⅢ做双酶切鉴定)，DNA测序鉴定。
1.2.4 重组质粒转染 采用脂质体Lipofectamine 2000转染小鼠胚胎成纤维细胞3T3细胞株，荧光显微镜观察细胞，随机选取10个视野，荧光细胞数与总细胞数之比为转染效率。
1.2.5 转染后3T3细胞中Wnt—5a mRNA的表达情况 采用RNeasy Mini试剂盒分离纯化各组细胞的总RNA，分光光度法测定计算提取的总RNA含量及浓度。根据GenBank上小鼠Wnt—5a的mRNA功能全长序列，采用Primer 5.0设计一对引物，其引物序列如下：Sense 5′—GGCATCAAGGAATGCCAGTA—3′，Antisense 5′—GTACGTGAAGGCCGTCTCTC—3′，扩增产物的片段长度为120 bp。设计并合成内参照β—actin引物，Sense 5′—TGAGCGCAAGTACTCTGTGTGGAT—3′ ，Antisense 5′—ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA—3，扩增产物的片段长度为95 bp。参照OneStep RT—PCR试剂盒实验操作说明进行RT—PCR，以空白组为对照，采用2—△△CT法计算Wnt—5a mRNA的相对表达量。
2 结果
2.1 目的基因Wnt—5a的克隆
提取小鼠组织总RNA经RT—PCR获得目的基因，琼脂糖凝胶电泳分析显示片段长度约1.4 kb ，片段大小与预期值一致(图1)。
图1 Wnt—5a目的基因电泳结果
2.2 重组质粒PMX—IRES—Wnt5a的构建与鉴定
将PMX—IRES—GFP逆转录病毒载体经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后与上述PCR纯化产物连接获得重组质粒，酶切鉴定(质粒采用BamHⅠ和HindⅢ做双酶切鉴定)，DNA测序鉴定。测序结果经BLAST比较与GenBank上收录的原始序列一致。
2.3 重组质粒转染
转染72 h后，荧光显微镜观察可见大量绿色荧光，提示转染成功，转染效率为4×107 TU/mL。
2.4 转染后3T3细胞中Wnt—5a mRNA的表达情况
与空白组比较，Wnt—5a表达明显增高(图2)。电泳结果显示Wnt—5a扩增产物的片段长度为120 bp，内参照β—actin扩增产物的片段长度为95 bp，与预期结果一致，表明重组质粒转染成功(图3)。
图2 转染7 d后3T3细胞中Wnt—5a mRNA的相对表达水平
图3 RT—PCR检测转染后3T3细胞中Wnt—5a mRNA的表达
3 讨论
大面积烧伤患者创面愈合后常常会发生瘢痕挛缩畸形，加上自体皮源的匮乏，给后期整复带来了很大的困难。复合皮(composite skin)的出现为解决这一难题提供了一种新的临床治疗方法[1]。当前烧伤医学强调在挽救生命的基础上重视患者生存质量的改善，复合皮移植虽然使深度烧伤患者皮肤的部分功能得到改善或恢复，但由于缺乏必要的皮肤附属器官如皮脂腺、汗腺、毛囊，导致皮肤干燥、温度失衡，严重影响了患者的生存质量[2]。如何在复合皮中实现毛囊、汗腺等附件的重建及皮肤附件再生机制的研究是复合皮移植研究的未来发展趋势。
汗腺、皮脂腺大多通过毛囊开口于皮肤表面，毛囊再生是皮肤功能性再生的标志；传统观点认为受损皮肤的毛囊是无法自主再生的，国外学者在《Nature》上发表的最新研究报告表明毛囊可以再生[3 ......
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