RALYL在胃癌中的表达(2)
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参见附件。
RALYL和内参GAPDH的引物都用Primer 5软件合成，RALYL上游引物为5’- GAGTCTAGTGCTGATCCAAG-3’，下游引物为5’-CCTCCTCTATCCCATCTGT -3’，内参GAPDH的上游引物为5’-ACCCACTCCTCCACCTTTGA-3’，下游引物序列为5’-ACCACCCTGTTGCTGTAGCC -3’。
使用Takara的实时荧光定量PCR试剂盒，实时荧光定量PCR仪器是ABI7000，PCR反应体系为20 μL，其中包括1 μL cDNA，9 μL SYBR Green mix，上下游引物各0.8 μL，ROX 0.4 μL，双蒸水8 μL、扩增条件是95°C孵育2 min，然后95°C变性5 s，60°C退火30 s，68°C延伸30 s，进行40个循环。实验完毕后收集数据进行统计分析。
1.3 免疫组化分析及评价
对72例乳腺浸润性癌和癌旁正常组织进行免疫组化分析，所有的步骤均按照经典的程序：首先进行脱蜡和水化，将石蜡切片放在二甲苯溶液中浸泡20 min，重复1次，然后使用梯度浓度的乙醇(无水乙醇、95%、90%、85%、80%)浸泡，自来水冲洗，然后在微波炉中加热，用枸橼酸钠缓冲液浸泡的组织切片进行抗原修复，PBS缓冲液冲洗后加入H2O2溶液灭活过氧化物酶活性，然后用非免疫性动物血清BSA 37°C进行抗原封闭30 min，弃血清后加入RALYL抗体(Abcam，Britain，1∶200稀释)50 μL，4°C过夜。最后经PBS缓冲液冲洗之后，加入生物素标记的二抗50 μL孵育30 min，再次经PBS缓冲液冲洗后加入链霉菌抗生素过氧化物酶溶液孵育30 min后加入DAB溶液显色，显微镜下观察掌握染色程度，最后用苏木素复染，自来水冲洗后脱水、透明、封片和镜检。
实验人员分别独立地对这些免疫组化结果进行了评价，采用的标准如下：根据细胞染色的比例进行打分，0分为阴性，1分为阳性细胞≤10%，2分为11%～50%，3分为51%～75%，4分为>75%。染色强度打分标准：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。染色强度和染色细胞比例乘积得分分别为：0、1、2、3、4、6、8、9、12。≤4分我们认为RALYL蛋白表达降低，≥6分认为蛋白表达升高[11]。
1.4 统计学分析
采用SPSS 13.0统计学软件进行统计分析，计量资料采用t检验；对免疫组化结果，RALYL蛋白表达和临床特征之间关系采用χ2检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 实时荧光定量PCR统计分析
对收集的37对胃腺癌和癌旁正常组织进行中进行实时荧光定量PCR实验，结果在31例胃腺癌组织中RALYL表达低于癌旁正常组织(t = 4.079，P < 0.01)。在胃腺癌和癌旁正常组织中RALYL表达差异有统学意义。
2.2 胃腺癌和癌旁正常组织的免疫组化分析
在正常的胃组织中，RALYL蛋白主要分布在上皮细胞的包浆和包膜上。72例胃腺癌中46例RALYL蛋白表达降低，而在癌旁正常组织中，只有31例RALYL表达较低，χ2=6.28，P = 0.012，在RALYL的蛋白水平，胃腺癌和癌旁正常组织表达差异有统计学意义。
图2 A图 胃腺癌细胞免疫组化阴性(200×)；B图 胃腺癌免疫组化强阳性(200×)；C图 正常胃黏膜上皮细胞免疫组化强阳性(200×)
2.3 RALYL蛋白表达和临床特征之间的关系
为探讨RALYL蛋白在胃腺癌中的表达情况与临床特征之间的关系，使用χ2检验对其进行统计分析。72例胃腺癌中，46例RALYL蛋白表达降低(分数≦4分)，而表达升高的仅26例(分数≥6分)。通过统计我们发现，胃腺癌中RALYL的表达水平和肿瘤大小(χ2=5.131，P = 0.024)、T期(χ2=7.99，P = 0.018)、N期(χ2=11.372，P = 0.001)和M期(χ2=8.428，P = 0.004)有关，而与年龄(χ2=0.253，P = 0.615)和性别(χ2=2.346，P = 0.126)无关。见表1。
3 讨论
目前我国人死因1/4为癌症，而癌症死因的1/4为胃癌，在消化系统的恶性肿瘤中，约半数死于胃癌[12-15]。当前胃癌主要的治疗手段是手术、放疗、化疗以及生物靶向治疗等，但是不幸的是胃腺癌对放疗的敏感性比较低。根据统计大约70%的胃癌患者早期无任何症状，等症状出现时，往往已经是中晚期肿瘤，患者的治疗疗效与预后极差[13]。因此早发现是改善胃癌疗效、提高生存率的关键[17]。
RALYL属于RALY亚家族 ......
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