心肌营养素—1在急性肝衰竭大鼠中的动态变化(1)

http://www.100md.com 2012年11月15日 潘珍珍　陈永平　潘陈为

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     [摘要] 目的 观察心肌营养素-1(CT-1)在急性肝衰竭大鼠中的动态变化及意义探讨。 方法 大鼠腹腔注射D-氨基半乳糖(D-Gal)建立急性肝衰竭模型，在造模后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、120 h、168 h分别留取肝组织，用RT-PCR法检测肝脏CT-1mRNA的表达，并用免疫组织化学方法检测环氧化酶-2(COX-2)蛋白的表达。 结果 CT-1在正常大鼠中表达很少，造模后12 h开始表达增多(P < 0.05)，于48 h时达高峰值，随后逐渐下降； COX-2在正常组未见蛋白表达，造模后6 h表达量逐渐增多，至48～72 h时达高峰。 结论 CT-1参与了D-Gal诱导的肝衰竭模型的发生发展，有可能为急性肝衰竭的治疗提供一个新的治疗靶点。

    [关键词] 心肌营养素-1；急性肝衰竭；环氧化酶-2

    [中图分类号] R575 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2012)32-0001-03

    心肌营养素-1(cardiotrophin-1，CT-1)是Pennica D等[1]于1995年发现的IL-6家族新成员，它具有广泛的生物活性。最近的研究发现，CT-1 在多种肝损伤的动物模型中发挥着较好的保护作用，促进肝细胞再生作用。急性肝衰竭(acute liver failure， ALF)是由于肝细胞大量坏死而导致肝功能严重受损为特征的综合征，因此如何减少肝细胞的凋亡和坏死、促进残存肝细胞再生，是改善急性肝衰竭患者预后的重要因素。本实验通过建立急性肝衰竭大鼠模型，采用半定量逆转录聚合酶反应法(RT-PCR)检测肝组织中CT-1的表达，并结合肝功能、COX-2的相应变化以探讨CT-1在急性肝衰竭中的作用。

    1 材料和方法

    1.1 药品及试剂

    RT-PCR试剂盒(晶美生物公司)，引物由上海基康公司合成，二步法免疫组化检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司产品，PV-6001)，COX-2单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司，ZA-0515)，D-Gal(重庆医科大学生物工程研究室，批号20041018)。

    1.2 动物模型及分组

    雄性SD大鼠，48只，体重200 g左右(温州医学院动物中心提供)，用随机数字表将大鼠分成2组。A组(肝衰竭模型组42只)：将10%的D-氨基半乳糖按1.4 g/kg剂量腹腔注射，建立肝衰竭模型。分别于造模后的6、12、24、48、72、120、168 h 7个时间点各处死6只大鼠，取血及肝组织。B组(正常对照组6只)：按1.4 g/kg剂量生理盐水腹腔内注射，记为0 h，取血及肝组织。

    1.3 肝功能检测

    采用全自动生化分析仪检测ALT、AST水平。

    1.4 COX-2蛋白表达的检测及HE染色

    用10%中性甲醛固定的肝组织，石蜡包埋，4 μm病理切片，按说明书进行免疫组化染色及HE染色，COX-2免疫组化结果使用美国IPP5.0(Image Pro-plus 5.0)专业图像分析软件测定平均光密度值，用阳性部位的光密度值减去背景的光密度值，即为阳性部位的吸光度值。

    1.5 CT-1mRNA表达的检测

    按Trizol试剂盒说明提取RNA，用半定量RT-PCR测定肝组织CT-1mRNA的表达。三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参。GAPDH引物：上游 5'-ACCACAGTCCATGCCAT-3'，下游：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，产物452bp。CT-1引物：上游5'-GCCAAGATCCGACAGACAC -3'，下游：5'- GC ACAGCATCCAATAGCG-3'，产物241bp。PCR扩增参数：95℃5 min；94℃ 30 s；56℃ 45 s；72℃ 40 s；35个循环；72℃ 7 min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶上电泳，并用100bp Ladder Marker 作分子量标准，在凝胶成像系统显像，用Gel-Pro 3.1软件半定量分析不同时相CT-1/GAPDH灰度比值。

    1.6 统计学分析

    采用SPSS11.5软件进行统计处理，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。方差齐性者两两比较采用LSD-T法，方差不齐者进行Dunnet’s T3法。P < 0.05差异有统计学意义。

    2 结果

    2.1 肝功能ALT、AST水平变化

    肝衰竭模型组大鼠ALT、AST造模后6 h就开始上升(P < 0.05)，于48～72 h达高峰值，此后逐渐下降。见表1。

    2.2 HE染色结果 ......

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