颜茂华 许斌 赵立来 朱求亮 罗建民 杨正明

    1.浙江省安吉县人民医院骨科，浙江安吉313300；2.浙江大学医学院附属第二医院，浙江杭州310009

    微小RNA-144上调Rb抑制骨肉瘤细胞增殖及诱导凋亡

    颜茂华1许斌1赵立来1朱求亮1罗建民1杨正明2

    1.浙江省安吉县人民医院骨科，浙江安吉313300；2.浙江大学医学院附属第二医院，浙江杭州310009

    目的探讨微小RNA-144(miR-144)对骨肉瘤细胞增殖、凋亡及相关蛋白影响。方法运用脂质体转染的方法，在骨肉瘤细胞株MG-63中转染不同浓度miR-144类似物(miR-144组)，随机miR-144片段作为阴性对照组。实时定量PCR检测miR-144表达水平。DAPI染色观察miR-144对细胞形态的影响，用MTT检测细胞增殖，Annexin/PI双染确定细胞凋亡比例。免疫印迹检测PTEN以及Rb等抑癌基因编码蛋白和凋亡相关蛋白表达情况。结果实时定量PCR结果显示，miR-144组miR-144的表达(1128.54±738.52)明显高于空白对照组(1.00±0.00)和阴性对照组(2.06±0.73)(P1 材料与方法

    1.1 材料来源

    人骨肉瘤细胞株MG-63、U-2 OS、Saos-2细胞购自上海生命科学研究院细胞资源中心，购买后大扩并保存一批MTT、DMSO，凋亡检测试剂盒购自南京凯基公司，DAPI购自Sigma公司，miRNA144类似物购自上海吉玛制药技术有限公司，序列为FAM-5’-UACAGUAUAGAUGAUGAUGUACU-3’。阴性对照(Control，缩写为“Con”)miRNA为随机合成，序列为FAM-5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’，DEPC水溶解后制备成10 μM储液用于细胞转染。空白对照组为不含RNA的转染试剂组。与大鼠基因组各基因均无显著同源性。临用时根据要求使用完全培养液稀释为目标浓度。RPMI-1640培养液为Gibco公司产品，小牛血清购自杭州四季青生物科技有限公司，转染试剂Lipofectmine 2000脂质体购自Life Technology公司。其余试剂均为分析纯或者分子试剂级别。

    1.2 细胞培养

    将冻存的骨肉瘤细胞株从液氮罐取出，细胞常规复苏及传代。取对数生长期细胞，以0.25%的胰蛋白酶消化后用PBS(pH7.2)洗涤3次，用含体积分数为10%的小牛血清RPMI 1640培养液将细胞终浓度调至8×104细胞/mL，接种到96孔或6孔板中 ......