盐酸小檗碱和亚胺培南联合作用耐碳青酶烯类铜绿假单胞菌的体外药敏实验研究(1)
[摘要] 目的 探讨盐酸小檗碱和亚胺培南联合作用对耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(CPA)体外抗菌活性的影响。方法 实验采用肉汤稀释法测定盐酸小檗碱和亚胺培南耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌最小抑菌浓度(MIC)；采用棋盘稀释法测定盐酸小檗碱联合亚胺培南对CPA的MIC，并计算联合指数(FIC)。 结果 盐酸小檗碱和亚胺培南对耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌MIC的算术均数分为268.80 μg/mL和8.93 μg/mL。用亚胺培南与盐酸小檗碱联合作用后，盐酸小檗碱与亚胺培南MIC的算术均数分别降至8.16 μg/mL和4.50 μg/mL。两种药物联合使用对6.7%的60株CPA有协同的抗菌作用，对88.3%CPA呈现相加作用，对5.0%CPA呈现无关作用，无拮抗作用。 结论 盐酸小檗碱和亚胺培南联合作用可以增加两者对CPA抗菌作用的敏感性。
[关键词] 盐酸小檗碱；铜绿假单胞菌；协同作用；碳青霉烯酶；亚胺培南
[中图分类号] R446.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701(2017)01-0114-04
铜绿假单胞菌是常见的条件致病菌，也是医院院内感染的重要致病菌[1]，常引起呼吸道感染、败血症、伤口感染、尿路感染等，近年来其分离率和耐药率都不断的呈上升趋势[2]。根据2013年全国细菌耐药监测数据，铜绿假单胞菌对碳青霉稀类的耐药率达到25%以上，且出现了广泛耐药菌株[3]。铜绿假单胞菌对抗菌药物耐药形势非常严峻，给临床治疗带来了难题。
盐酸小渠碱是中药黄连提取物，也是一种生物碱，《中国药典》记载黄连和盐酸小檗碱具有抗菌消炎等药理作用[4]。有关盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌的抗菌作用研究很少。本实验拟通过盐酸小檗碱和亚胺培南的体外联合药敏试验研究，评价两种药物的联合用药的抗菌效果。为临床治疗耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌“超级细菌” 提供实验依据和新的治疗思路。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 在2014年1月1日～2015年12月31日期间，从台州恩泽医院和台州路桥医院住院患者中各分离40株和60株CPA(剔除重复分离菌株)。100株临床菌株通过法国梅里埃VITEK2-CompactT检测，然后通过Hodge实验[5]确认筛选出耐碳氢酶烯类铜绿假单胞菌60株。质控菌株27853购于中国卫生部临检中心。
1.1.2 抗菌药物 盐酸小檗碱分析标准品批号为160528，纯度98%，规格1 g/支；亚胺培南批号为160421，纯度98%，规格5 g/支，购于上海源叶生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 菌悬液的制备 实验前将所有保存菌种经复融、转种、分离培养，在同一平板上取性状相似1～2个菌落，接种到LB液体培养基内10～12 h。再用 RPMI1640液体培养基调节细菌LB培养液使其密度为2～6×108 CFU/L 菌悬液备用。实验时再将备用菌悬液用RPMI1640培养基稀释到100倍，最终密度为2～6×106 CFU/L接种菌悬液。
1.2.2 药物浓度的配制 先用无菌蒸馏水把盐酸小檗碱和亚胺培南干粉碱分别配成2048 μg/mL和256 μg/mL的原液。NCCLS抗生素药敏微量稀释原理：盐酸小檗碱起始浓度为2048 μg/ml，第1孔的浓度为2048 μg/mL，然后再用RPMI1640液稀释对药物进行倍比稀释，稀释到第10管孔浓度为2 μg/mL，得到的盐酸小檗碱的浓度范围在2～1024 μg/mL之间。亚胺培南起始浓度为256 μg/mL，用同样的方法稀释最终得到亚胺培南的浓度范围在0.125～128 μg/mL之间。
1.2.3 盐酸小檗碱和亚胺培南单独药敏试验 根据NCCLS微量倍比稀释原理在96孔的V型检测板加入药敏原液并稀释至第10孔为最低检测浓度的2倍，然后再第1孔至第11孔加入50 μL稀释好的菌懸液，使最终每孔菌液浓度为l×105 CFU/mL，第11孔为不加细菌的对照孔，第12孔为空白对照孔。然后混匀加盖置37℃孵育箱，18～24 h后观察结果。
1.2.4 盐酸小檗碱交叉联合抗真菌药物药敏试验 采用棋盘微量稀释法检测药物的联合作用，采用9个稀释度，药物最高浓度为其MIC的4倍，依次倍比稀释为1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256倍浓度，两种药物稀释分别在96孔培养板上按横和纵两列进行联合[7]。接种菌量为1×105 CFU/mL，铜绿假单胞菌分别于37℃孵育18～24 h后观察细菌生长情况。用部分抑菌浓度指数(FIC)作为评价联合药敏试验效果。
1.2.5 FIC的计算及判定标准[6] FIC=MIC甲药联合/MIC甲药单用+MIC乙药联合/MIC乙药单用结果判断：①FIC指数≤0.5判定甲乙两药为协同作用；②0.52判定甲乙两药为拮抗作用。
2 结果
2.1 单药作用
盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌MIC范围为256～512 μg/mL，MIC几何均值为265.02 μg/mL；亚胺培南对耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌MIC范围为8～32 μg/mL MIC几何均值为8.57 μg/mL。
2.2 联合用药
两种药物联合使用时，盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌MIC减至为2～32 μg/mL；亚胺培南对耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌MIC减至为2～16 μg/mL见表1。两种药物对6.7%的耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌有协同的抗菌作用，88.3%耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌呈现相加作用，对5.0%耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌呈现无关作用，无拮抗作用，见表1。, 百拇医药(石庆新 吕小萍 於青峰 杨阳)
[关键词] 盐酸小檗碱；铜绿假单胞菌；协同作用；碳青霉烯酶；亚胺培南
[中图分类号] R446.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701(2017)01-0114-04
铜绿假单胞菌是常见的条件致病菌，也是医院院内感染的重要致病菌[1]，常引起呼吸道感染、败血症、伤口感染、尿路感染等，近年来其分离率和耐药率都不断的呈上升趋势[2]。根据2013年全国细菌耐药监测数据，铜绿假单胞菌对碳青霉稀类的耐药率达到25%以上，且出现了广泛耐药菌株[3]。铜绿假单胞菌对抗菌药物耐药形势非常严峻，给临床治疗带来了难题。
盐酸小渠碱是中药黄连提取物，也是一种生物碱，《中国药典》记载黄连和盐酸小檗碱具有抗菌消炎等药理作用[4]。有关盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌的抗菌作用研究很少。本实验拟通过盐酸小檗碱和亚胺培南的体外联合药敏试验研究，评价两种药物的联合用药的抗菌效果。为临床治疗耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌“超级细菌” 提供实验依据和新的治疗思路。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 在2014年1月1日～2015年12月31日期间，从台州恩泽医院和台州路桥医院住院患者中各分离40株和60株CPA(剔除重复分离菌株)。100株临床菌株通过法国梅里埃VITEK2-CompactT检测，然后通过Hodge实验[5]确认筛选出耐碳氢酶烯类铜绿假单胞菌60株。质控菌株27853购于中国卫生部临检中心。
1.1.2 抗菌药物 盐酸小檗碱分析标准品批号为160528，纯度98%，规格1 g/支；亚胺培南批号为160421，纯度98%，规格5 g/支，购于上海源叶生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 菌悬液的制备 实验前将所有保存菌种经复融、转种、分离培养，在同一平板上取性状相似1～2个菌落，接种到LB液体培养基内10～12 h。再用 RPMI1640液体培养基调节细菌LB培养液使其密度为2～6×108 CFU/L 菌悬液备用。实验时再将备用菌悬液用RPMI1640培养基稀释到100倍，最终密度为2～6×106 CFU/L接种菌悬液。
1.2.2 药物浓度的配制 先用无菌蒸馏水把盐酸小檗碱和亚胺培南干粉碱分别配成2048 μg/mL和256 μg/mL的原液。NCCLS抗生素药敏微量稀释原理：盐酸小檗碱起始浓度为2048 μg/ml，第1孔的浓度为2048 μg/mL，然后再用RPMI1640液稀释对药物进行倍比稀释，稀释到第10管孔浓度为2 μg/mL，得到的盐酸小檗碱的浓度范围在2～1024 μg/mL之间。亚胺培南起始浓度为256 μg/mL，用同样的方法稀释最终得到亚胺培南的浓度范围在0.125～128 μg/mL之间。
1.2.3 盐酸小檗碱和亚胺培南单独药敏试验 根据NCCLS微量倍比稀释原理在96孔的V型检测板加入药敏原液并稀释至第10孔为最低检测浓度的2倍，然后再第1孔至第11孔加入50 μL稀释好的菌懸液，使最终每孔菌液浓度为l×105 CFU/mL，第11孔为不加细菌的对照孔，第12孔为空白对照孔。然后混匀加盖置37℃孵育箱，18～24 h后观察结果。
1.2.4 盐酸小檗碱交叉联合抗真菌药物药敏试验 采用棋盘微量稀释法检测药物的联合作用，采用9个稀释度，药物最高浓度为其MIC的4倍，依次倍比稀释为1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256倍浓度，两种药物稀释分别在96孔培养板上按横和纵两列进行联合[7]。接种菌量为1×105 CFU/mL，铜绿假单胞菌分别于37℃孵育18～24 h后观察细菌生长情况。用部分抑菌浓度指数(FIC)作为评价联合药敏试验效果。
1.2.5 FIC的计算及判定标准[6] FIC=MIC甲药联合/MIC甲药单用+MIC乙药联合/MIC乙药单用结果判断：①FIC指数≤0.5判定甲乙两药为协同作用；②0.52判定甲乙两药为拮抗作用。
2 结果
2.1 单药作用
盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌MIC范围为256～512 μg/mL，MIC几何均值为265.02 μg/mL；亚胺培南对耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌MIC范围为8～32 μg/mL MIC几何均值为8.57 μg/mL。
2.2 联合用药
两种药物联合使用时，盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌MIC减至为2～32 μg/mL；亚胺培南对耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌MIC减至为2～16 μg/mL见表1。两种药物对6.7%的耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌有协同的抗菌作用，88.3%耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌呈现相加作用，对5.0%耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌呈现无关作用，无拮抗作用，见表1。, 百拇医药(石庆新 吕小萍 於青峰 杨阳)